Insights into the structural and functional properties of the eukaryotic porin Tom40

Abstract

Tom40 forms the preprotein conducting channel in the outer membrane of mitochondria enabling transport of up to 1500 different preproteins through an optimized pore environment. Moreover, Tom40 exhibits a voltage-dependent gating mechanism in terms of an ‘electrical switch’ making this eukaryotic beta-barrel a promising target for nanopore based applications. In this work, new bioinformatics methods were developed and verified through practical approaches to shed light on the structural elements of Tom40 facilitating its particular function in mitochondria. Based on these results, Tom40 proteins were designed with modified and optimized structural properties.

TmSIP, a physical interaction model developed for TM beta-barrel proteins, was used to identify weakly stable regions in the TM domain of Tom40 from mammals and fungi. Three unfavorable beta-strands were determined for human Tom40A. Via CD and Trp-fluorescence spectroscopy it was shown that substitution of key amino acid residues in theses strands resulted in an improved resistance of the protein to chemical and thermal perturbations. Further, the mutated form of hTom40A was strictly found in its monomeric state. Equal improvements were gained for the apparent stability of Tom40 from Aspergillus fumigatus.

Tom40 was isolated and purified in its native state from Neurospora crassa mitochondria. Time-limited proteolysis of native NcTom40 coupled to mass spectrometry revealed comparable protease-accessibility to VDAC isoform 1 from mammals suggesting a similar fold. Thus, a homology model of NcTom40 was developed on the basis of the solved mouse VDAC-1 crystal structure. It was found that Tom40 forms a 19-stranded beta-barrel with an N-terminal alpha-helix inside the pore. Further, a conserved ‘polar slide’ in the pore interior is possibly involved in preprotein translocation and a second conserved domain, termed ‘helix anchor region’, in arresting the helix inside the Tom40 pore.

Based on the homology model of NcTom40, the structure and function of the N-terminal domain of Tom40 was addressed. Examination of the model structure revealed two different domains for the N-terminus, the inner-barrel and outer-barrel N-terminus. In vivo investigations showed that both parts prevent a heat-induced dysfunction of Tom40 in N. crassa mitochondria independently. By applying CD spectroscopy the predicted N-terminal alpha-helix could be allocated to the inner-barrel N-terminus. Further, in combination with Trp-fluorescence spectroscopy it was found that the N-terminal alpha-helix unfolds independently from the Tom40 beta-barrel, but is not necessary for pore stability or integrity. However, a conserved amino acid residue, Ile47 of NcTom40, in the inner-barrel N-terminus is essential for the structural integrity of the N-terminal alpha-helix.

In conclusion, these results may offer a basis for future works on TM beta-barrel proteins with the aim to alter the structural properties in the absence of a high atomic resolution structure or an established knowledge of the biochemical and biophysical properties.

Tom40 bildet den Präprotein leitenden Kanal in der Außenmembran von Mitochondrien aus und ermöglicht den Transport von bis zu 1500 verschiedenen Präproteinen durch ein optimiertes Porenmilieu. Weiterhin besitzt Tom40 einen spannungsabhängigen Schaltmechanismus in der Form eines elektrischen Schalters. Diese Eigenschaften machen das eukaryotische Porin Tom40 zu einem vielversprechenden Objekt für Nanoporen-basierte Anwendungen. In dieser Arbeit wurden neue bioinformatische Anwendungen entwickelt und über empirische Ansätze verifiziert, um die strukturellen Elemente von Tom40, welche dessen spezielle Funktion in Mitochondrien ermöglichen, aufzudecken. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden neuartige Tom40 Proteine entwickelt, welche modifizierte und optimierte strukturelle Eigenschaften aufwiesen.

TmSIP ist ein physikalisches Interaktionsmodell, welches für die Identifizierung schwach-stabiler Transmembran (TM) Regionen in TM Beta-Barrel Proteinen entwickelt wurde. In dieser Arbeit wurde TmSIP verwendet, um schwach-stabile Regionen in der TM Domäne von Tom40 aus Säugetieren und Pilzen zu identifizieren. Drei energetisch ungünstige Beta-Stränge wurden in der TM Region von humanem Tom40A aufgedeckt. Unter Anwendung von Circulardichroismus (CD) und Tryptophan Fluoreszenzspektroskopie wurde gezeigt, dass der Austausch von bestimmten Aminosäureresten in diesen drei Strängen zu einer verbesserten Resistenz gegen chemische und thermische Perturbation führte. Weiterhin wurde aufgedeckt, dass die mutierte Form von humanem Tom40A grundsätzlich als Monomer vorlag. Es wurden gleichwertige Verbesserungen in der ‘scheinbaren’ Stabilität von Tom40 aus Aspergillus fumigatus erzielt.

Tom40 wurde in nativer Form aus Neurospora crassa Mitochondrien isoliert und gereinigt. Unter Kombination von zeitlich begrenzter Proteolyse und Massenspektrometrie von nativem NcTom40 wurde entdeckt, dass NcTom40 die gleiche Proteasezugänglichkeit wie VDAC Isoform 1 aus Säugetieren aufweist. Es kann daher eine ähnliche Faltung der Proteine angenommen werden und basierend auf der Kristallstruktur von Maus VDAC Isoform 1 wurde ein Homologiemodell von NcTom40 entwickelt. Tom40 bildet ein 19-strängiges Beta-Barrel Protein mit einer N-terminalen Extension aus, welche als Alpha-Helix in das Poreninnere gefaltet ist. Weiterhin ist eine konservierte ‘Polare Gleitfläche’ im Innern der Pore möglicherweise an der Translokation von Präproteinen beteiligt. Eine zweite konservierte Region auf der Innenseite der Pore, welche als ‘Helix Anker Region’ definiert wurde, hat dem Anschein nach die Funktion, die N-terminale Alpha-Helix zu arretieren.

Basierend auf dem Homologiemodell von NcTom40 wurde die Struktur und Funktion der N-terminalen Alpha-Helix untersucht. Die N-terminale Extension konnte in zwei unterschiedliche Domänen unterteilt werden, in den inneren und äußeren N-Terminus. Unter Anwendung von in vivo Analysemethoden wurde gezeigt, dass beide N-terminale Domänen eine hitzeinduzierte Fehlfunktion von Tom40 in N. crassa Mitochondrien unabhängig voneinander verhindern. Durch CD Spektroskopie konnte die im Modell vorhergesagte Alpha-Helix dem inneren N-Terminus zugewiesen werden. In Kombination von CD mit Tryptophan Fluoreszenzspektroskopie wurde weiterhin aufgedeckt, dass die N-terminale Alpha-Helix sich unabhängig vom Tom40 Beta-Barrel entfalten lässt und nicht für die Stabilität oder Integrität des Barrels erforderlich ist. Jedoch ist ein konservierter Aminosäurerest, Ile47 in NcTom40, für die Aufrechterhaltung der Struktur der N-terminalen Alpha-Helix notwendig.

Diese Ergebnisse können als Grundlage für zukünftige Arbeiten an TM Beta-Barrel Proteinen dienen, welche das Ziel verfolgen, die strukturellen Eigenschaften des Proteins zu verändern. Weiterhin können die hier beschriebenen Methoden und empirischen Ansätze zur Untersuchung von TM Beta-Barrel Proteinen angewendet werden, falls ein fundiertes biochemisches und biophysikalisches Wissen, sowie eine atomar aufgelöste Proteinstruktur noch nicht vorhanden sind.