Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-2018
Authors: Zettlitz, Kirstin Anja
Title: Engineered antibodies for the therapy of cancer and inflammatory diseases
Other Titles: Entwicklung von Antikörpern für die Therapie von Krebs und entzündlichen Erkrankungen
Issue Date: 2010
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-57000
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/2035
http://dx.doi.org/10.18419/opus-2018
Abstract: Detailed knowledge of the antibody structure and function allows researchers to engineer antibodies on a rational basis to design therapeutic antibodies dependent on the target antigen, therapeutic strategy and clinical setting. The development of therapeutic antibodies is a rapidly growing field with more than 30 antibodies approved over the past 25 years. Thereof, cancers as well as autoimmune and inflammatory diseases are the main indications. The purpose of the first part of this thesis was the cloning, chimerization and humanization of the monoclonal antibody (mAb) cmHsp70.1. This mouse mAb is specific for heat shock protein 70 (Hsp70) and able to bind the plasma membrane bound form (mHsp70), associated with various cancers including breast cancer, head-and-neck cancer, and acute myeloid leukemia. Humanization of cmHsp70.1 by grafting the complementarity-determining regions onto homologous human germline genes resulted in an antibody (humex) possessing a similar affinity (3 nM) as the parental antibody and an improved production and thermal stability. Epitope mapping confirmed that the parental, chimeric, and humanized antibodies recognize the same region including amino acids 473-504 of the Hsp70 substrate binding domain (SBD). Hence, this humanized antibody provides a basis for further development of a mHsp70-specific antibody therapy. The purpose of the second part of this thesis was to evaluate an appropriate format and an optimization strategy for a humanized antibody (IZI-06.1) specific for human tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1). Selective inhibition of TNFR1 provides the opportunity to neutralize the pro-inflammatory activity of TNF while maintaining the advantageous immunological responses mediated by TNFR2. Here, this humanized antibody was converted into an IgG1 molecule (ATROSAB) containing a modified human Fc region deficient in mediating effector functions. IgG ATROSAB was compared to monovalent antibody derivatives fused to human serum albumin (HSA). Using chimeric human/mouse TNFR1 molecules, the epitope of ATROSAB was mapped to the N-terminal region (amino acid residues 1-70) comprising the first cysteine-rich domain (CRD1) and the A1 sub-domain of CRD2. Purified ATROSAB, produced in CHO cells, inhibited in vitro typical TNF-mediated responses like apoptosis induction and activation of NFκB-dependent gene expression such as IL-6 and IL-8 production. Moreover, ATROSAB showed strong binding to human and rhesus TNFR1-Fc fusion protein with an affinity identical to the parental mouse antibody H398. These findings open the way to further analyze the therapeutic activity of ATROSAB in relevant disease models in non-human primates. Furthermore, phage display technology was used for affinity maturation of the humanized variable domains by site directed mutagenesis of CDR1 and CDR2 of each VH and VL. Attempts towards affinity maturation resulted in a mutant (scFv IG11) showing a two-fold increase in antigen binding affinity which also translated into slightly improved inhibition of TNF-mediated cytotoxicity in vitro. The results of this study indicate that further engineering of ATROSAB could offer a number of benefits for its therapeutic efficacy. TNFR1-selective antagonist, such as ATROSAB, will permit new therapeutic options for diseases where anti-TNF therapeutics failed or even exacerbate disease progression and could be an especially useful therapeutic alternative in diseases already known to clinically respond to anti-TNF treatment and particularly in those diseases where specific blockage of TNFR1 and maintenance of TNFR2 function appears as a promising therapeutic approach.
Detailliertes Wissen um die Struktur und Wirkungsweise von Antikörpern ermöglicht es Wissenschaftlern, Antikörper nach rationalen Grundlagen zu gestalten, abhängig von Zielstrukturen, therapeutischen Strategien und klinischen Vorgaben. Die Entwicklung von therapeutischen Antikörpern ist ein schnell wachsendes Fachgebiet, mit über 30 zugelassenen Antikörpern in den letzten 25 Jahren. Die häufigsten Indikationen davon sind Krebserkrankungen, sowie Autoimmun- und entzündliche Erkrankungen. Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Klonierung, Chimärisierung und Humanisierung des monoklonalen Antikörpers (mAb) cmHsp70.1. Dieser Maus-Antikörper ist spezifisch für das Hitze-Schock-Protein 70 (HSP70) und bindet dessen Plasmamembran-gebundene Form, welche mit verschiedenen Krebserkrankungen wie Brustkrebs, Kopf-Hals-Karzinom und akute myeloische Leukämie assoziiert ist. Die Humanisierung, durch Transplantation der „complementarity-determining regions“ (CDR) auf humane homologe Keimbahngene, resultierte in einem Antikörper (humex) mit vergleichbarer Affinität (3 nM) zum ursprünglichen Antikörper und verbesserter Produktivität und thermischer Stabilität. Die Epitop-Kartierung bestätigte, dass der parentale, der chimäre und der humanisierte Antikörper dieselbe Region der Substrate-Binde-Domäne (SBD) erkennen, diese Region umfasst die Aminosäuren 473-504. Folglich bietet dieser humanisierte Antikörper eine Basis für die weitere Entwicklung einer Membran-Hsp70 spezifischen Antikörper Therapie. Die Zielsetzung im zweiten Teil dieser Arbeit war die Evaluierung eines geeigneten Formats und einer Optimierungs-Strategie für einen humanisierten Antikörper (IZI-06.1), der spezifisch für den humanen Tumor Nekrose Faktor Rezeptor 1 (TNFR1) ist. Die selektive Blockierung von TNFR1 erlaubt die Neutralisierung der entzündlichen Wirkung von TNF, während die positiven TNFR2-vermittelten Immunantworten bestehen bleiben. Dieser humanisierte Antikörper wurde hier in ein IgG Molekül (ATROSAB) konvertiert, das einen modifizierten, Effektor-Funktion defizienten, humanen Fc Teil enthält. IgG ATROSAB wurde mit monovalenten, Albumin-fusionierten (humanes Serum Albumin, HSA) Antikörperfragmenten verglichen. Mittels chimärer (Human/Maus) TNFR1 Moleküle wurde das Epitope von ATROSAB in der N-terminalen Region (Aminosäuren 1-70) kartiert, es umfasst die erste CRD (Cysteine-reiche Domäne) und die Subdomäne A1 der CRD2. In CHO Zellen produzierter und gereinigter IgG ATROSAB blockierte in vitro typische TNF-vermittelte Reaktionen wie die Induktion von Apoptose und die Aktivierung von NFκB-abhängiger Genexpression, wie die Produktion von IL-6 und IL-8. Darüber hinaus zeigte ATROSAB starke Bindung an humanes und rhesus TNFR1-Fc Fusionsprotein mit einer identischen Affinität wie der parentale Maus-Antiköper H398. Diese Ergebnisse ermöglichen die weitere Analyse der therapeutischen Wirkung von ATROSAB in relevanten Krankheits-Modellen in nicht-humanen Primaten. Des Weiteren wurde zur Affinitäts-Reifung der humanisierten variablen Domänen Phagen-Display und gezielte Mutagenese (site directed mutagenesis) der CDR1 und CDR2 von VH und VL eingesetzt. Die angestrebte Affinitäts-Reifung führte zu einer Mutante (scFv IG11) mit verbesserter Antigen-Bindungs Affinität, was zu einer ebenfalls leicht verstärkten Blockierung von TNF-vermittelter Zytotoxizität in vitro führte. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass weiteres Engineering von ATROSAB einige Vorteile für die therapeutische Wirksamkeit bieten kann. TNFR1-spezifische Antagonisten, wie ATROSAB, ermöglichen neue therapeutische Optionen für Krankheiten in denen Anti-TNF Therapeutika keine Wirkung zeigten oder sogar den Krankheitsverlauf beschleunigten und könnten eine therapeutische Alternative sein, für Krankheiten die klinisch auf anti-TNF-Behandlung ansprechen und besonders für Krankheiten in denen die spezifische Blockierung von TNFR1 und die Erhaltung der TNFR2 Funktionen ein vielversprechender therapeutischer Ansatz ist.
Appears in Collections:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Diss_Kirstin_Zettlitz.pdf6,25 MBAdobe PDFView/Open


Items in OPUS are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.