Analysis of receptor-receptor interactions and their implications on the formation of signaling competent TRAIL receptor clusters

Abstract

The cytokine tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and its associated receptors constitute an elaborate signaling system fulfilling important functions in regulation of the immune system and in tumor surveillance. Two TRAIL membrane receptors, receptor 1 (TRAILR1) and receptor 2 (TRAILR2), possess an intracellular death domain. Activation of these receptors can lead to apoptosis in TRAIL susceptible cells, but also non-apoptotic signals can be induced. Two additional TRAIL receptors, TRAILR3 and TRAILR4, are generally referred to as decoy receptors. TRAILR3 is linked to the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol anchor, hence it is devoid of intracellular and transmembrane domains and thus most likely incapable of signal transduction. The intracellular domain of TRAILR4 contains merely a partial death domain consensus motif, therefore it is often referred to as a truncated death domain. Signaling capabilities of TRAILR4 are likely contextual and cell type-dependent, furthermore TRAILR4 can exclusively transduce non-apoptotic signals. Expression of either of the decoy receptors has been shown to reduce sensitivity to TRAIL-induced apoptosis. However, the underlying molecular mechanisms, in particular concerning TRAILR4, remain vaguely defined. Alike other members of the tumor necrosis factor receptor superfamily, TRAIL receptors contain a pre-ligand binding assembly domain (PLAD) in their extracellular domain which mediates receptor-receptor interactions. However, the outcome of TRAIL receptor oligomerization, that is the stoichiometry of the formed complexes as well as the issue whether the PLAD mediates only homotypic or also heterotypic interactions, remained inconclusive until now. Accordingly, different techniques for the investigation of protein-protein interactions were applied in order to study ligand-independent oligomerization of TRAIL receptors 1, 2 and 4. Interactions of these TRAIL receptors in all six possible combinations were demonstrated through fluorescence resonance energy transfer. The stoichiometry of the resulting TRAIL receptor complexes was clarified through chemical crosslinking experiments. Homophilic interaction of the death receptor TRAILR2, as well as heterophilic interactions between the two death receptors or between either of the death receptors and the decoy receptor TRAILR4 resulted in the formation of dimeric complexes. Subsequent biochemical assays and biosensor measurements performed with the soluble extracellular domains of TRAILR1 and TRAILR4 confirmed that ligand-independent dimerization is an intrinsic capability of the extracellular domains of TRAIL receptors. The implications of the demonstrated receptor-receptor interactions on TRAIL-induced signal transduction were investigated in cellular models expressing TRAILR1 and either wild type or a truncated, non-signaling variant of TRAILR4. The apoptotic effects of TRAIL were significantly reduced in presence of TRAILR4 and this reduction was directly correlated to the expression level of receptor 4. Not only inhibition of proapoptotic signaling could be demonstrated, but also reduced activation of the transcription factor NFkappaB, assessed by analyzing the phosphorylation of its inhibitor IkappaBalpha. Accordingly, TRAILR4 exerted a general inhibitory function on signaling by TRAILR1 in the studied cellular model. The inhibitory capacity of TRAILR4 could be clearly attributed to signaling-independent mechanisms. This could be demonstrated through the capacity of the truncated non-signaling receptor variant to interfere with TRAIL-mediated signaling to a comparable extent as the wild type receptor. The reduced cellular sensitivity to the apoptotic effects of TRAIL manifested itself already at the level of procaspase-8 processing, indicating that TRAILR4 impedes proapoptotic signaling early in the extrinsic apoptosis pathway. As a molecular mechanism underlying this, I propose the reduction of signaling competent death receptor dimers through PLAD-mediated formation of mixed receptor complexes. Furthermore, no intracellular signaling pathways emanating from TRAILR4, neither constitutive nor ligand-induced, could be identified in the studied cellular system. The reported experimental findings were integrated into a model explaining the capability of TRAILR4 to interfere with apoptosis induction by TRAIL death receptors through ligand-independent receptor pre-assembly. Moreover, the proposed model affirms the necessity to take account of TRAILR4 expression in matters of TRAIL-based tumor therapy.

Das Zytokin Tumornekrosefaktor-verwandter Apoptose-induzierender Ligand (TRAIL) und die zugehörigen Rezeptoren bilden ein kompliziertes Signalisierungssystem, dem wichtige Funktionen in der Regulation des Immunsystems und im Schutz vor Tumoren zukommen. Zwei TRAIL Membranrezeptoren, Rezeptor 1 (TRAILR1) und Rezeptor 2 (TRAILR2), besitzen eine intrazelluläre Todesdomäne. Aktivierung dieser Rezeptoren kann in TRAIL sensitiven Zellen zu Apoptose führen, jedoch können auch nicht-apoptotische Signale ausgelöst werden. Zwei weitere TRAIL Rezeptoren, TRAILR3 und TRAILR4, werden generell als Köderrezeptoren bezeichnet. TRAILR3 ist über einen Glykosylphosphatidylinositol-Anker mit der Plasmamembran verbunden, folglich besitzt er weder eine intrazelluläre, noch eine transmembranäre Domäne und kann daher wahrscheinlich keine intrazellulären Signale auslösen. Die intrazelluläre Domäne von TRAILR4 enthält lediglich ein partielles Todesdomänen Konsensusmotives, daher wird sie oft als verkürzte Todesdomäne bezeichnet. Die Fähigkeit von TRAILR4 intrazelluläre Signale auszulösen ist vermutlich vom Zelltyp und dem zellulären Kontext abhängig, des Weiteren ist die Signaltransduktion auf nicht-apoptotische Signale beschränkt. Es konnte gezeigt werden, dass beide Köderrezeptoren die Sensitivität von Zellen gegenüber TRAIL vermittelter Apoptose verringern können, allerdings sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, insbesondere im Fall von TRAILR4, unklar. Wie auch andere Mitglieder der Superfamilie der TNF Rezeptoren besitzen TRAIL Rezeptoren eine Assemblierungsdomäne (PLAD) in ihrer extrazellulären Domäne, die Rezeptor-Rezeptor Interaktionen vermittelt. Allerdings ist das Resultat der TRAIL Rezeptor Oligomerisierung, also die Stöchiometrie der gebildeten Komplexe sowie die Frage ob die PLAD nur homotypische oder auch heterotypische Interaktionen vermittelt, bis heute nur unvollständig geklärt. Daher wurden verschiedene Techniken zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen angewendet, um die Ligand-unabhängige Oligomerisierung der TRAIL Rezeptoren 1, 2 und 4 zu analysieren. Interaktionen dieser Rezeptoren in allen sechs möglichen Kombinationen konnten durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer nachgewiesen werden. Die Stöchiometrie der resultierenden Komplexe wurde durch Verwendung eines chemisch quervernetzenden Agens aufgeklärt. Homophile Interaktion von Molekülen des Todesrezeptors TRAILR2, heterophile Interaktionen zwischen beiden Todesrezeptoren sowie zwischen einem der Todesrezeptoren und dem Köderrezeptor TRAILR4 resultierten in der Bildung von dimeren Rezeptor Komplexen. Nachfolgende biochemische Untersuchungen und Biosensor Messungen unter Verwendung der löslichen extrazellulären Domänen von TRAILR1 und TRAILR4 bestätigten, dass die Ligand-unabhängige Dimerisierung eine intrinsische Fähigkeit der extrazellulären Domänen von TRAIL Rezeptoren ist. Die Auswirkungen der nachgewiesenen Rezeptor-Rezeptor Interaktionen auf die TRAIL vermittelte Signaltransduktion wurden anschließend in zellulären Modellen untersucht, die TRAILR1 und entweder Wildtyp oder eine verkürzte nicht-signalisierende Variante von TRAILR4 exprimierten. In Gegenwart von TRAILR4 waren die apoptotischen Effekte von TRAIL signifikant reduziert und es konnte gezeigt werden, dass das Ausmaß dieser Reduktion direkt mit dem Expressionsniveau von TRAILR4 korrelierte. Nicht nur proapoptotische Signale wurden gehemmt, auch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB war in Gegenwart von TRAILR4 vermindert. Folglich übt TRAILR4 eine allgemeine hemmende Wirkung auf die Signalisierung durch TRAILR1 aus. Die nicht signalisierende Rezeptorvariante interferierte in vergleichbarem Ausmaß wie der Wildtyp Rezeptor mit der TRAIL-vermittelten Signaltransduktion. Daher konnte die inhibitorische Eigenschaft von TRAILR4 eindeutig signalisierungs-unabhängigen Mechanismen zugeschrieben werden. Die verminderte zelluläre Sensitivität gegenüber den apoptotischen Effekten von TRAIL manifestierte sich bereits auf der Ebene der Procaspase-8 Spaltung, was daraufhin deutet, dass TRAILR4 an einem frühen Punkt im extrinsischen apoptotischen Signalweg die Signalisierung hemmt. Als zugrundeliegenden molekularen Mechanismus schlage ich eine Reduzierung der signalisierungsfähigen dimeren Todesrezeptorkomplexe durch PLAD-vermittelte Ausbildung von gemischten Rezeptorkomplexen vor. Des Weiteren konnten in dem untersuchten zellulären System keine von TRAILR4 (weder konstitutiv noch Ligand-abhängig) ausgehenden Signalwege identifiziert werden. Die gezeigten experimentellen Ergebnisse können in einem Modell zusammengefasst werden, dass aufzeigt wie TRAILR4 durch Ligand-unabhängige Oligomerisierung die apoptotische und nicht-apoptotische Signaltransduktion durch Todesrezeptoren hemmt. Darüber hinaus zeigt das vorgeschlagene Modell auf, weshalb die Expression von TRAILR4 in Zusammenhang mit TRAIL-basierten Ansätzen zur Tumor-Therapie berücksichtigt werden sollte.