Etablierung von Methoden zur Studie von molekularen Wechselwirkungen in S. cerevisiae basierend auf dem erweiterten genetischen Code

Abstract

Zahlreiche Methoden zur Studie von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen wurden bereits etabliert. Jedoch fehlt es an Methoden, welche die Wechselwirkungen hoch aufgelöst und zugleich im natürlichen Kontext beschreiben. Eine neue Möglichkeit für die Entwicklung neuer Ansätze bietet der erweiterte genetische Code. Hierbei werden nicht-kanonische Aminosäuren mit neuen physikalisch-chemischen Eigenschaften an definierte Positionen in Proteine in vivo eingebaut. In dieser Arbeit wurden unter Verwendung des erweiterten genetischen Codes und den photoreaktiven nicht-kanonischen Aminosäuren p-Azidophenylalanin sowie p-Benzoyl-phenylalanin Ansätze für die Erforschung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo entwickelt. Hierbei wurden beide nicht-kanonischen Aminosäuren positionsspezifisch mithilfe einer orthogonalen tRNA sowie der entsprechenden orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase aus E. coli in die Modellproteine eingebaut. Zugleich wurde auch die Wirkung der orthogonalen Komponenten des erweiterten genetischen Codes auf den hier verwendeten Modellorganismus S. cerevisiae analysiert. Für die Etablierung einer Methode zur Studie von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurde das Co-Chaperon Aha1 als Modellprotein verwendet. Dabei wurde eine zuvor in der Literatur beschrieben Bindedomäne zu Hsp90 untersucht. An acht unterschiedliche Positionen in der Bindedomäne wurde p-Azidophenylalanin eingebaut und eine Interaktion dieser mutagenisierten Aha1-Proteine zu Hsp90 mittels einer nativen Co-Immunpräzipitation bestätigt. Anders als ursprünglich erwartet, wurde durch die Belichtung mit UV-Licht jedoch kein Heterodimer bestehend aus Hsp90 und Aha1, sondern ein Homodimer bestehend aus zwei Aha1-Monomeren quervernetzt und massenspektrometrisch identifiziert. Die Ausbildung des quervernetzten Homodimers war nur in Abhängigkeit von UV-Licht, von der genauen Einbauposition der nicht-kanonischen Aminosäure im Protein und der Zugabe der nicht-kanonischen Aminosäure möglich. Dieses Homodimer konnte auch mit einer weiteren photoreaktiven nicht-kanonischen Aminosäure p-Benzoylphenylalanin bestätigt werden. Mit der in dieser Arbeit etablierten Methode konnte eine zuvor in vitro beschriebene Bindedomäne von Aha1 zu Hsp90 nicht bestätigt werden. Stattdessen konnte gezeigt werden, dass diese Bindedomäne bei der Ausbildung von Homodimeren in vivo eine Rolle spielt. Für die Etablierung einer Methode zur Studie von Protein-DNA-Wechselwirkungen wurde der Transkriptionsfaktor Gal4 als Modellprotein verwendet. Gal4 konnte in Abhängigkeit von p-Azidophenylalanin mit der spezifischen GAL7-Promotersequenz quervernetzt und dieser Protein-DNA-Komplex deutlich angereichert werden. Allerdings hat sich Gal4 im Laufe der Experimente als ungeeignet für die Etablierung eines globalen Ansatzes zur Charakterisierung aller Gal4-DNA-Bindestellen herausgestellt, da es bei Überexpression eine toxische Wirkung auf die Zellen zeigte. Zusammengefasst zeigt sich, dass der erweiterte genetische Code einen vielversprechenden Ansatz bietet, um Protein-Protein aber auch Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu studieren.

Numerous methods for the study of protein-DNA and protein-protein interactions have already been established. However, there is a lack of methods describing the interactions in detail and at the same time in the natural context. The expanded genetic code represents a novel opportunity for the development of new approaches. In this context, non-canonical amino acids with novel physical-chemical properties are incorporated in proteins at defined positions in vivo. In this work, using the expanded genetic code and the photoreactive non-canonical amino acids such as p-azido-L-phenylalanine or p-benzoyl-L-phenylalanine novel approaches for the study of protein-DNA and protein-protein interactions in vivo were developed. Both photoreactive amino acids were incorporated position-specific into the model proteins using an orthogonal tRNA as well as the corresponding orthogonal aminoacyl tRNA synthetase from E. coli. At the same time, the effect of the orthogonal components on the behaviour of the model organism S. cerevisiae was also examined. Using the co-chaperone Aha1 as a model protein a method for the study of protein-protein interactions was established. Here, the previously described binding domain of Aha1 to Hsp90 was examined. Within the binding domain p-azido-L-phenylalanine was specifically incorporated at eight different positions. First of all, the interaction of the Aha1 mutants to Hsp90 was confirmed using native co-immunoprecipitation. In contrast to what was originally expected instead of a heterodimer consisting of Hsp90 and Aha1 a homodimer consisting of two covalently cross-linked Aha1 monomers were identified by mass spectrometry after the exposition to UV light. The formation of the cross-linked homodimer was depending on irradiation with UV light, the exact position of the non-canonical amino acid in the protein sequence as well as on the addition of the non-canonical amino acid to the growth media. This homodimer was confirmed by another photoreactive non-canonical amino acid p-benzoyl-L-phenylalanine. With the method established in this work, a previously described in vitro binding domain of Aha1 to Hsp90 could not be confirmed. Instead it could be shown that this binding domain plays a role in the formation of an Aha1 homodimer in vivo. To establish a new method for the study of protein DNA interactions the transcription factor Gal4 was used as a model protein. Gal4 could be covanlently cross-linked to a specific GAL7 promoter sequence depending on p-azido-L-phenylalanine and this sequence was markedly enriched. However, since the overexpression of Gal4 revealed a toxic effect in the course of the experiments Gal4 was found to be unsuitable for the establishment of a global approach for the characterization of all the Gal4 DNA binding sites. Taken together the expanded genetic code proved to be a promising approach for protein-protein as well as protein-DNA interaction in vivo.