Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-2165
Authors: Färber-Schwarz, Aline
Title: Serum albumin and its interaction with the neonatal Fc receptor (FcRn) : characterization of the albumin/FcRn-binding mechanism
Other Titles: Serumalbumin und seine Interaktion mit dem neonatalen Fc-Rezeptor (FcRn) : eine Charakterisierung des Albumin/FcRn-Bindemechanismus
Issue Date: 2013
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-87573
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/2182
http://dx.doi.org/10.18419/opus-2165
Abstract: In the past a lot of different biomolecular therapeutics were developed. A common problem using small molecules in therapy is their reduced serum concentration after short time period. The human body clears therapeutic molecules which have a size beneath the kidney clearance threshold in minutes to hours. The consequences are more frequent and high application doses. These facts demand the development of half-life prolonging strategies. plasma proteins, like IgG’s and albumin are recycled by the neonatal Fc receptor (FcRn) resulting in an extraordinary long circulating half-life which is used to prolong the serum circulation of small therapeutic proteins. Non-covalent binding or fusion to the Fc-part of IgG’s or albumin significantly improves the pharmacokinetic properties of small proteins. The aim of this study was to understand the interaction mechanism between albumin and the FcRn and to investigate the impact of point-mutations on the pharmacokinetic properties of albumin. A set of mouse serum albumin (MSA) mutants was generated and their pharmacokinetics were analyzed in vivo. Mutations of H464, E501, E505, D512, H510, S511, E531, H535, D565, T570 and E571 affect the in vivo half-life of albumin in mice. Even if these results are statistically not significant they still suggest the importance of the investigated amino acid residues for the albumin/FcRn binding. The highly conserved histidine residues H464, H510 and H535 play a major role in the albumin/FcRn interaction. In addition to the in vivo experiments a steered molecular dynamic (SMD) visualizes that the domain III of albumin removes as the last part of the protein from the receptor. Furthermore, the polar interactions beween MSA and the mouse FcRn were analyzed. Thus the amino acids S111 and L112 within the domain I and the amino acids E425, L466, T467 and P468 within the domain III of albumin were identified to be responsible for the FcRn interaction. Moreover, phage display was used to mature the affinity of MSA towards the mouse FcRn. A MSA library has been generated by site directed mutagenesis of five amino acids within the domain III of albumin. The selection of MSA variants with an increased affinity to the FcRn was not successful. Further approaches are required to mature the affinity of MSA towards the mouse FcRn.
In den letzten Jahren wurde zunehmend an der Entwicklung kleiner biotherapeutischer Moleküle zur Therapie verschiedenster Krankheiten geforscht. Ein Nachteil der kleinen Moleküle ist, dass sie bedingt durch ihre geringe Größe, die zu einer rapiden Abnahme der Serumkonzentration durch die renale Filtration und Degradation führt, nur eine kurze Zirkulationsdauer im Körper aufweisen. Die kurze Zirkulationsdauer reduziert die Wirksamkeit der Biotherapeutika und macht häufige Applikationen notendig. Um diese Proteine als effektiv wirkende Therapeutika einsetzen zu können, ist es somit wichtig eine längere Halbwertszeit im Plasma zu erreichen. Plasmaproteine wie IgGs und Serum Albumin weisen eine lange Zirkulationsdauer im Plasma auf. Diese lange Halbwertszeit, die durch das Recycling der beiden Proteine über den neonatalen Fc-Rezeptor erreicht wird, macht man sich zunutze, um die Halbwertszeit kleiner Proteine zu verbessern. Zum einen besteht die Möglichkeit IgG sowie Albumin durch IgGbinde Proteine und Albumin-binde Proteine nicht kovalent an die gewünschten therapeutischenMoleküle zu koppeln. Zum anderen ist es auch möglich rekombinant produzierte Fc-Teile oder Albumin an die Therapeutika zu fusionieren. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Interaktion von Albumin mit dem neonatalen Fc-Rezeptor und den Einfluss von Mutationen in Albumin auf die Halbwertszeit von Antikörper-Albumin-Fusionsproteinen zu untersuchen. Dazu wurden verschiedene Punktmutanten von MSA als Fusionsproteine hergestellt und deren Halbwertszeit in vivo analysiert. Die Mutationen der Aminosäuren H464, E501, E505, D512, H510, S511, E531, H535, D565, T570 und E571 führten in allen Fällen zu einer Reduktion der Halbwertszeit der Albumin-Fusionsproteine. Obwohl diese Ergebnisse statistisch nicht signifikant sind, deuten sie darauf hin, dass die untersuchten Aminosäuren an der Bindung des FcRn beteiligt sind. Dabei übernehmen die hochkonservierten Histidine H464, H510 und H535 der Domäne III eine wichtige Rolle. Zusätzlich zu den in vivo Experimenten wurde eine in silico Simulation der Bindung von Albumin an den FcRn durchgeführt. Eine Molekulardynamiksimulation hat gezeigt, dass sich die Domäne III als letzter Teil des Albumins vom Rezeptor löst. Zusätzlich wurden die polaren Interaktionen zwischen MSA und dem FcRn analysiert. Dabei wurden die Aminosäuren S111 und L112 der Domäne I und die Aminosäuren E425, L466, T467 und P468 der Domäne III als potenzielle FcRn-Interaktionspartner identifiziert. Des Weiteren wurde zur Affinitätsreifung von MSA durch gezielte Mutagenese (site directed mutagenesis) von fünf Aminosäuren der Domäne III eine Phagen Bibliothek hergestellt. Die angestrebte Affinitäts-Reifung von MSA führte nicht zum Erfolg. Demzufolge sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Affinität von MSA gegüber dem neonatalen Fc-Rezeptor zu optimieren.
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