Spektroskopische Charakterisierung der Rubber Oxygenase RoxA aus Xanthomonas sp. 35Y

Abstract

Thema dieser Arbeit ist die Charakterisierung der "Rubber Oxygenase A" (RoxA), einer extrazellulären Di-Häm-Dioxygenase aus dem Gram-negativen Bakterium Xanthomonas sp. 35Y. RoxA katalysiert die oxidative Spaltung von Naturkautschuk (Poly(cis-1,4-isopren)) in Produkte mit Aldehyd- und Keto-Enden. Es wurde eine Charakterisierung des Enzyms durch UV-Vis- und EPR (Electron Paramagnetic Resonance)-Spektroskopie durchgeführt. Das EPR-Spektrum von RoxA "as isolated" weist konstante low-spin-Signale der His-His-koordinierten C-terminalen Hämgruppe und variable high- und low-spin-Signale der N-terminalen Hämgruppe mit nur einem His-Liganden auf. Ferner wurde erstmals das CD (Circular Dichroism)-Spektrum von RoxA beschrieben. Im Rahmen einer Inhibitor-Studie wurde eine Hemmung der RoxA-katalysierten Spaltungsreaktion durch Reduktions- und Oxidationsmittel, substratähnliche Substanzen und typische Hämliganden wie z. B. Imidazol festgestellt. Insgesamt erlaubten diese Untersuchungen auch eine kritische Einschätzung des Aktivitätstest-Verfahrens. Es wurde eine zweistufige chromatographische Reinigung von rekombinant homolog exprimiertem RoxA etabliert. Anhand unterschiedlicher {alpha}-Banden bei 549 nm bzw. 553 nm sind die Hämzentren im reduzierten Zustand zu unterscheiden. Übereinstimmend mit einer sukzessiven, bald aufeinander folgenden Reduktion der Hämgruppen, belegten Redoxtitrationen kaum unterscheidbare Häm-Redoxpotentiale bei –65 mV und etwa –145 mV. Die räumliche Struktur von RoxA, die in Kooperation mit der AG Einsle (Freiburg) in einer Auflösung von 1,8 Å erhalten wurde, zeigt das C-terminale Häm His-His-koordiniert, das N-terminale nur von einem His-Rest und einem "O"-Liganden an sechster Position. Auf dieser Grundlage konnte die spektroskopische Untersuchung das etwas höhere Redoxpotential und die {alpha}-Bande bei 549 nm dem N-terminalen Häm zuordnen und zeigen, dass dieses bereits in RoxA "as isolated" für die Bindung externer Hämliganden zugänglich ist. EPR-Spektren weisen auf die Lokalisierung von Poly(cis-1,4-isopren) in der nahen Umgebung, nicht aber direkt am Häm-Fe des gleichen Hämzentrums hin, und veranschaulichen eine erschwerte Hämliganden-Bindung bei Anwesenheit von Latex. Die RoxA-Struktur zeigt eine Ähnlichkeit zu bakteriellen Cytochrom c Peroxidasen (CCPs) und MauG-Proteinen in der Anordnung beider Hämgruppen, sowie einiger konservierter Aminosäuren in deren Umgebung. Dennoch weist die unpolare Umgebung des katalytischen Zentrums in RoxA einen klaren Unterschied zu diesen Enzymen auf. Aufgrund der fehlenden Peroxidase-Aktivität und Inhibierung durch H2O2, sowie beträchtlicher Unterschiede der Häm-Redoxpotentiale zu CCPs, widerlegen die Ergebnisse eindeutig, dass RoxA eine Funktion als Peroxidase erfüllt. Wichtige Erkenntnisse zu den Redox- und Spinzuständen der beiden Hämzentren in RoxA lieferten Versuchsansätze nach Reduktion und anschließender Reoxidation durch Luftsauerstoff im Vergleich zu anderen Oxidationsmitteln. Die Untersuchung des in Abwesenheit von Kautschuklatex exprimierten rekombinanten RoxA erlaubte Aussagen zum Grundzustand des Enzyms vor dem Kontakt mit dem Substrat. So unterstützen EPR-Spektren einen diamagnetischen, EPR-unsichtbaren Zustand des N-terminalen Hämzentrums in RoxA "as isolated". Damit zusammenhängend, entsprachen in Gegenwart von Oxidationsmitteln eintretende Veränderungen im optischen Spektrum solchen, die nach Entfernung von Sauerstoff eintraten. Die Annahme einer stabilen Fe(II)–O2<–>Fe(III)–O2•– -Koordination in RoxA "as isolated" bietet eine gemeinsame Erklärung für diese Phänomene. Diese Ergebnisse erlauben die Erstellung eines Rahmens für den katalytischen Mechanismus der Kautschukspaltung durch RoxA: Als Startpunkt der Spaltungsreaktion wird ein oxygenierter Grundzustand angenommen, dessen Stabilität darüber hinaus für ein c-Typ-Cytochrom sehr ungewöhnlich ist und an ein O2-Bindeprotein erinnert. Zudem verweisen die Ergebnisse auf den Ablauf der Kautschukspaltung allein am N-terminalen Hämzentrum, das eine Funktion zur Bindung und Aktivierung von O2 erfüllt. Für eine Beteiligung der C-terminalen Hämgruppe gibt es keine Hinweise. Auch zeigt die Struktur von reduziertem RoxA keine Konformationsänderung an. Das Kautschukpolymer könnte durch einen hydrophoben Kanal zum katalytischen Hämzentrum gelangen. RoxA ist bislang das einzige c-Typ-Cytochrom, von dem eine Dioxygenase-Aktivität beschrieben ist. In jüngerer Zeit wurden jedoch zum RoxA-Protein ähnliche Genprodukte in den Gram-negativen Haliangium ochraceum (Hoch_1661, Hoch_1441) und Myxococcus fulvus (LILAB_11505), sowie Ähnlichkeiten in der jeweiligen genomischen Umgebung gefunden. Deren Entdeckung regt die Diskussion über eine Entwicklung unterschiedlicher Kautschuk spaltender Enzyme in Gram-positiven (Lcp) und Gram-negativen Bakterien (RoxA), sowie die Existenz weiterer RoxA-Homologen in Xanthomonas sp. an.

The subject of this thesis is the characterization of the "Rubber Oxygenase A" (RoxA) from the Gram-negative Xanthomonas sp. 35Y. RoxA is an extracellular di-heme dioxygenase and catalyses the cleavage of natural rubber (Poly(cis-1,4-isoprene)) in products with aldehyde- and keto-ends. A detailed characterization of the enzyme with UV-Vis- and EPR (Electron Paramagnetic Resonance) -Spectroscopy was carried out. The EPR-spectrum of RoxA as isolated contains non-varying low-spin-signals of the His-His-coordinated C-terminal heme group and variable high- and low-spin-signals of the N-terminal heme with only one His-ligand. For the first time the CD (Circular Dichroism) -spectrum of RoxA was described. It was found that an inhibition of the RoxA-catalysed cleavage reaction by reducing- and oxidizing agents, substrate-like compounds and typical heme ligands like imidazole. This inhibitor study enabled a critical evaluation of the activity test procedure. A chromatographic purification from the Xanthomonas sp. culture supernatant was established in two steps. The heme centers are distinguishable in the reduced state by means of two different {alpha}-bands at 549 nm and 553 nm, respectively. In agreement with a fast consecutive reduction of the hemes, redox titrations confirm hardly distinguishable heme-potentials at –65 mV and –145 mV. The three-dimensional structure of RoxA was solved in cooperation with the group of O. Einsle (Freiburg, Germany) to a resolution of 1.8 Å. It shows the C-terminal heme His-His-coordinated, the N-terminal heme with only one Histidine and one "O"-ligand at the sixth coordination site. Based on this structure the spectroscopic investigation could assign the slightly higher potential and the 549 nm -{alpha}-band to the N-terminal heme center. It was shown that his heme already is accessible for the binding of external heme ligands in RoxA as isolated. EPR-spectra suggest the localization of Poly(cis-1,4-isoprene) in the vicinity of the same heme center, but not directly at the Fe-coordination site, and demonstrate that binding of heme ligands in the presence of rubber latex is hindered. The structure of RoxA exhibits similarity to bacterial cytochrome c peroxidases (CCPs) and MauG proteins in the arrangement of both heme groups as well as some surrounding conserved amino acids. However, the unpolar environment of the catalytic center in RoxA demonstrates a distinct difference to these enzymes. Because of the absent peroxidase activity and inhibition by H2O2, as well as significant differences of the heme redox potentials to those of CCPs, the results clearly disprove that RoxA is a peroxidase. Important findings concerning the redox- and spin states of each heme center in RoxA were provided by experiments of reduction and following reoxidation by O2 compared to other oxidizing agents. The investigation of recombinant RoxA that was expressed in the absence of rubber latex allowed assertions about the ground state of RoxA before contact to the substrate. Therefore, EPR-spectra support a diamagnetic, EPR-silent state at the N-terminal heme in RoxA as isolated. Connected with this observation, changes in the optical spectrum in the presence of oxidizing agents resemble those after removal of dioxygen. The assumption of a stable Fe(II)–O2<–>Fe(III)–O2•– -coordination in RoxA as isolated provides a common explanation of these findings. These obtained results enable set limits to the catalytic mechanism of rubber cleavage by RoxA: The starting point of the cleavage reaction is assumed as an oxygenated ground state, whose stability furthermore is extraordinarily stable for a c-type cytochrome and is reminiscent of an O2-binding protein. In addition, the results indicate the reaction cycle of rubber cleavage proceeds solely at the N-terminal heme center, which serves a role in binding and activation of dioxygen. There is no evidence for an involvement of the C-terminal heme. Moreover, the structure of reduced RoxA does not display any conformational change. Possibly the rubber polymer could reach the catalytic heme center through a hydrophobic channel. So far, RoxA is the only c-type cytochrome, of which a dioxygenase activity is described. Recently, similar gene products in Gram-negative Haliangium ochraceum (Hoch_1661, Hoch_1441) and Myxococcus fulvus (LILAB_11505) as well as similarities in their particular genomic context were found. Their discovery encourages the discussion about the development of different rubber cleaving enzymes in Gram-positive (Lcp) and Gram-negative bacteria (RoxA), as well as the existence of further RoxA homologous in Xanthomonas sp. 35Y.