Regulation of the BH3-only protein NOXA in mantle cell lymphoma : relevance for novel treatment concepts

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive form of non-Hodgkin lymphoma and characterized by only transient responses to chemotherapy and relatively short survival. Extensive research is ongoing to improve current therapy and identify novel targets for treatment of this B cell malignancy. The central role of BH3-only proteins in mediating the response of tumor cells to anticancer drugs has been shown by many studies. The present work aimed at the investigation of the role of the BH3-only protein NOXA in the decision between life and death in MCL. Astonishingly, basal NOXA mRNA and NOXA protein expression levels were found in this study to be extremely discrepant in MCL cell lines as well as primary cells from MCL patients. The malignant B cells express very high constitutive levels of NOXA mRNA. In strong contrast, NOXA protein levels are very low in MCL cell lines and even hardly detectable in primary MCL cells. It could be demonstrated in this study that chronic active B-cell receptor (BCR)-signaling and Cyclin D1 overexpression, the hallmark of MCL, contribute to the maintenance of the high constitutive transcript levels of the pro-apoptotic Bcl-2 family member. Furthermore, the phoshatidyl-inositol-3 kinase (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway was determined as the major mediator responsible for the high NOXA mRNA expression downstream of the BCR and surprisingly also Cyclin D1. Overexpression of the cell cycle regulatory protein Cyclin D1 contributes to enhanced NOXA transcription by exerting a positive feedback loop on the PI3K/AKT/mTOR signaling. Increased expression of the pro-apoptotic Bcl-2 family member NOXA is generally implicated in induction of cell death. Intriguingly, the high basal transcript levels of the BH3-only protein do not impair viability of MCL cells. The malignant B cells adapt to this permanent pro-apoptotic signal by extensive polyubiquitination and rapid proteasome-mediated degradation of NOXA (T½ < 30 min). Importantly, the resulting phenotype of high NOXA mRNA and low NOXA protein expression appears to constitute a druggable Achilles heel of MCL. Exposure of the cells to the proteasome inhibitor Bortezomib accumulates NOXA protein and efficiently induces apoptosis. In addition to Bortezomib, the neddylation inhibitor MLN4924 and the fatty acid synthase inhibitor Orlistat were identified in the present study as effective inducers of NOXA protein and NOXA-dependent apoptosis in MCL. Such as Bortezomib, both inhibitors target rapid NOXA protein turnover thereby stabilizing the pre-existing pool of the pro-apoptotic protein. Interestingly, in contrast to the proteasome inhibitor, MLN4924 as well as Orlistat interfere with ubiquitination of NOXA and stabilize the BH3-only protein in a proteasome independent manner. Therefore, these substances not only represent alternatives to Bortezomib treatment but may also offer new approaches to treat Bortezomib resistant MCL cells. Indeed, results from the present work demonstrate that Bortezomib resistant MCL cells were still sensitive to Orlistat and MLN4924. Remarkably, active PI3K/AKT/mTOR signaling is needed for effective accumulation of NOXA and induction of cell death upon treatment with Bortezomib, Orlistat or MLN4924 indicating that the high constitutive NOXA mRNA levels are essential for the sensitivity of MCL cells to inhibitors targeting NOXA turnover. Especially fatty acid metabolism appears to represent a very promising target for treatment of MCL. Constitutive Cyclin D1 overexpression in MCL was found to have an inhibitory effect on cellular metabolism thereby rendering MCL cells susceptible to drugs targeting the fatty acid synthase such as Orlistat. Furthermore, inhibition of fatty acid metabolism may not only constitute a new and selective strategy to kill MCL cells but also sensitize the malignant B cells to other anticancer drugs. In summary, the present study highlights a critical role of the BH3-only protein NOXA in MCL and provides evidence that the regulation of the pro-apoptotic protein might represent an Achilles heel of this aggressive tumor. Targeting the phenotype of high NOXA mRNA/low NOXA protein expression by inhibitors inferring with different steps of the ubiquitin-proteasome system may provide a novel therapeutic approach to kill MCL cells and improve clinical outcome of this lymphoid neoplasm.

Das Mantelzell-Lymphom (MCL) zählt zu den Non-Hodgkin Lymphomen und ist gekennzeichnet durch einen aggressiven klinischen Verlauf. MCL-Patienten sprechen häufig nur kurzeitig auf konventionelle Chemotherapie an und haben eine sehr schlechte klinische Prognose. Um eine effizientere Therapie zu ermöglichen und neue Behandlungsansätze zu identifizieren werden verstärkt Forschungsbemühungen unternommen. Die zentrale Rolle der „BH3-only“-Proteine für das Ansprechen von Tumorzellen auf Chemotherapeutika wurde in verschiedenen Arbeiten gezeigt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle des „BH3-only“-Proteins NOXA bei der Entscheidung zwischen Überleben und Tod im Mantelzell-Lymphom zu erforschen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine extreme Diskrepanz zwischen der basalen Expression an NOXA-mRNA und NOXA-Protein in MCL-Zelllinien sowie in primären Zellen von MCL-Pateinten beobachtet. Die malignen B-Zellen sind gekennzeichnet durch eine sehr hohe Expression an NOXA-mRNA. Im Gegensatz dazu sind die basalen NOXA-Proteinlevel nur in geringem Maße in den MCL-Zelllinien bzw. kaum in primären MCL-Zellen nachzuweisen. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die chronische Aktivierung des B-Zell-Rezeptor (BCR)-Signalwegs sowie die für das MCL charakteristische Überexpression an Cyclin D1 zum Erhalt der konstitutiv hohen mRNA-Expression des pro-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieds beitragen. Darüber hinaus wurde der Phoshatidyl-inositol-3 Kinase (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR)-Signalweg als wichtigster dem BCR nachgeschalteten Signalweg, der für den hohen Level an NOXA-Transkript in den MCL-Zellen verantwortlich ist, identifiziert. Die Überexpression von Cyclin D1 scheint überraschenderweise durch eine positive Rückkopplungsschleife auf den PI3K/AKT/mTOR-Signalweg zu der hohen NOXA-mRNA-Expression beizutragen. Eine erhöhte Expression von NOXA wird gewöhnlich mit der Induktion von Zelltod in Verbindung gebracht. Erstaunlich ist, dass die erhöhte Transkription von NOXA keinen negativen Einfluss auf die Viabilität der MCL-Zellen zu haben scheint. Die malignen B-Zellen passen sich durch extensive Polyubiquitinierung und verstärkten proteasomalen Abbau von NOXA-Protein an das konstitutive pro-apoptotische Signal an (T½< 30 min). Dieser Phänotyp einer hohen NOXA-mRNA-Expression und einem geringen NOXA-Proteinlevel scheint eine durch Medikamente angreifbare Achilles-Sehne des MCLs darzustellen. Setzt man die Zellen dem Proteasomeninhibitor Bortezomib aus, führt dies zu einer raschen und effizienten Anreicherung an NOXA-Protein und der Induktion von Zelltod. Neben Bortezomib konnten im Rahmen dieser Arbeit mit dem Neddylierengsinhibitor MLN4924 und dem Fettsäure-Synthaseinhibitor Orlistat zwei weitere Induktoren des NOXA-Proteins und des NOXA-abhängigen Zelltods in MCL-Zellen identifiziert werden. Ebenso wie Bortezomib sind beide Inhibitoren in der Lage, den rapiden Abbau von NOXA-Protein zu stoppen und den bereits existierenden Pool des pro-apoptotischen Proteins zu stabilisieren. Im Gegensatz zu Bortezomib beeinträchtigen MLN4924 sowie Orlistat jedoch die Ubiqitinierung von NOXA und stabilisieren das „BH3-only“-Protein unabhängig vom Proteasom. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, stellen diese Substanzen somit nicht nur Alternativen zu Proteasomeninhibitoren dar, sondern eröffnen auch neue Möglichkeiten für die Behandlung von Bortezomib-resistenten MCL-Zellen. Bemerkenswert ist, dass ein aktiver PI3K/AKT/mTOR-Signalweg für eine effiziente Akkumulierung des NOXA-Proteins und Zelltodinduktion nach Behandlung der malignen B-Zellen mit den Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems notwendig ist. Dies deutet darauf hin, dass die Sensitivität der MCL-Zellen gegenüber diesen Inhibitoren von der konstitutiv hohen NOXA-mRNA Expression abhängig ist. Der zelluläre Fettsäurestoffwechsel in MCL-Zellen könnte ein sehr erfolgsversprechendes Ziel für neue Behandlungsansätze zu sein. Wie in der vorliegenden Arbeit beschrieben werden konnte, hat die konstitutive Überexpression von Cyclin D1 in MCL einen hemmenden Einfluss auf die zelluläre Stoffwechselaktivität und macht die Zellen somit angreifbarer für Inhibitoren des Fettsäuremetabolismus wie beispielsweise Orlistat. Darüber hinaus könnten Inhibitoren des Fettsäuremetabolismus nicht nur eine neue und sehr selektive Möglichkeit darstellen, um MCL-Zellen zu töten, sondern auch dazu beitragen, dieses aggressive Lymphom gegenüber anderen Krebsmedikamenten sensitiver zu machen. Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass das „BH3-only“-Protein NOXA eine kritische Rolle im MCL spielt und, dass dessen Regulation möglicherweise eine Achilles-Sehne dieses aggressiven Tumors darstellt. Das gezielte Eingreifen in die diskrepante Expression von NOXA-mRNA und NOXA-Protein durch verschiedene Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems könnte eine neuer Ansatz für ein gezieltes Angreifen von MCL-Zellen sein und zur Verbesserung des Therapieerfolges beitragen.