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Authors: Ghanegaonkar, Shashank
Title: Heterologous biosynthesis of 2-methyl-6-geranylgeranyl benzoquinone and δ-tocotrienol in recombinant Escherichia coli strains
Other Titles: Heterologe Biosynthese von 2-Methyl-6-geranylgeranylbenzochinon und δ-Tocotrienol in rekombinanten Escherichia coli Stämmen
Issue Date: 2013 Dissertation
Abstract: Vitamin E is a group of lipid soluble compounds, consisting of 4 forms (δ, β,α,γ) of tocopherols and tocotrienols, each. In nature, all 8 vitamin E compounds are exclusively synthesized by photosynthetic (except the recently reported non-photosynthetic eukaryote, Plasmodium falciparum). α-tocopherol is ubiquitously found while δ-tocotrienol is a rare form of Vitamin E. Unlike α-tocopherol, δ-tocotrienol has unique biological functions in humans and animals like anti-cancer, neuroprotective, hypocholesterolemic effects in-addition to antioxidant activity. Humans and animals cannot produce any of the Vitamin E compounds, and hence form an essential dietary component. δ-tocotrienol (i.e. single stereoisomer, as found in nature) can be synthesized via a series of asymmetric chemical reactions or extracted from food sources. Both methods have their own limitations i.e. lower reaction yields and low levels in fresh food respectively. In this work, a new approach for the biosynthesis of δ-tocotrienol and its precursor, 2-methyl-6-geranylgeranyl benzoquinol (MGGBQ) in recombinant non-photosynthetic Escherichia coli (E. coli) strain, has been investigated. To realise the heterologous biosynthesis of δ-tocotrienol (in recombinant E. coli, 4 additional genes, encoding for p-hydroxyphenyl-pyruvate dioxygenase (Hpd) from Pseudomonas putida, geranylgeranylpyrophosphate synthase (CrtE) from Pantoea ananatis, homogentisate phytyltransferase (Hpt-Syn) from Synechocystis sp. PCC6803, and tocopherol cyclase (Cyc-At) from Arabidopsis thaliana, were successfully cloned and over-expressed in recombinant E. coli encoded within one expression plasmid. The plasmid-encoded strains produced homogentisic acid (HGA) and/or geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) and/or MGGBQ, and/or δ-tocotrienol when tested for in-vivo activity in complex medium. In order to scale up any fermentation process from pilot to industrial scale, the heterologous genes should be stable (segregational and structural), during fermentation. Use of plasmid-encoded strains has a risk for segregational instability, resulting in loss of productivity, while use of antibiotics is expensive and undesired in some products. To solve these problems a robust plasmid-free recombinant E. coli strains were constructed, which could produce MGGBQ and δ-tocotrienol. Homologous recombination methods were used in which the rare sugar degradation loci in E. coli BW25113 lacZ+, were replaced by gene expression cassettes using a simple, reliable chromosomal integration, and screening method, based on λ-red mediated recombination techniques. These methods allow easy screening of clones and allow elimination of the antibiotic resistance cassette by transient expression of flippase (FLP) recombinase. The hpd- and crtE expression cassettes were integrated in the fucose and maltose locus of E. coli strain respectively, to obtain plasmid-free E. coli CS1 and E. coli CS2.1 strains. Plasmid-encoded E. coli BW25113/pCAS2JF strain produced 60 % more (1213 ± 45 µg/l vs. 750 ± 34 µg/l) and 40 % less (870 ± 69 µg/l vs. 530 ± 43 µg/l) HGA than plasmid-free E. coli CS1 strain in glucose and glycerol medium respectively. Lipophilic GGPP produced in plasmid-free E. coli CS2.1 and E. coli LJ110/pCAS30 was analysed by a new simple and sensitive GC-MS method. Plasmid-free strain showed a robust GGPP production in terms of yield i.e. nmol of GGPP/ gram of cell dry weight (CDW). GGPP yield in plasmid-free E. coli CS2.1 strain was higher than in plasmid-encoded E. coli LJ110/pCAS30 strain (310 ± 19 nmol/g CDW and 249 ± 14 nmol/g CDW respectively). HGA and GGPP undergo a decarboxylation and prenylation reaction to form MGGBQ. This reaction is catalysed by Hpt-Syn. Chromosomal integration of hpt-Syn expression cassette in a plasmid-free strain capable of producing HGA and GGPP resulted in a new plasmid-free E. coli CS6 strain. MGGBQ yields achieved in plasmid-free E. coli CS6 strain were 604 ± 24 µg/g CDW vs. 325 ± 13 µg/g CDW, and 669 ± 31 µg/g CDW vs. 554 ± 29 µg/g CDW than that produced in plasmid-encoded E. coli BW25113/pCAS29 strain in glucose and glycerol containing medium, respectively. One reason for the lower MGGBQ yield in plasmid-encoded E. coli strains is the lower segregational stability i.e. approx. 50 % and approx. 40 % of cells had lost the plasmids, during fermentation in glucose and glycerol medium respectively. Similar to HGA, MGGBQ is also an unstable compound undergoes oxidation to form 2-methyl-6-geranylgeranylbenzoquinone (MGGBQ oxidised) and further polymerise to produce brown pigment. Mass Spectroscopy (MS) analysis of MGGBQ revealed a mass of 396 and 394 Da, which corresponded to the calculated mass of MGGBQ reduced and MGGBQ oxidised, respectively. MGGBQ produced in plasmid-free E. coli CS6 strain was enriched and the proposed chemical structure was elucidated by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Tocopherol cyclase (Cyc) enzyme, catalyzes the ring closing reaction on the aromatic head at C1 position of MGGBQ to produce δ-tocotrienol. Integration of cyc-At expression cassette in E. coli CS6 strain resulted in a new plasmid-free E. coli CS7 strain. Plasmid-free E. coli CS7 strain successfully produced higher MGGBQ than produced in plasmid-encoded strain E. coli BW25113/pCAS47, in glucose and glycerol medium respectively i.e. 1581 ± 82 µg/g CDW vs. 940 ± 32 µg/g CDW and 1026 ± 23 µg/g CDW vs. 346 ± 13 µg/g CDW. Unexpectedly, the conversion of high level of MGGBQ into δ-tocotrienol, in case of plasmid-free strain was lower, compared to that in plasmid-encoded strain. E. coli BW25113/pCAS47 strain produced approx. 2.5 times and 1.5 times higher δ-tocotrienol, compared to plasmid-free E. coli CS7 strain in glucose & glycerol medium i.e. 9.4 ± 0.9 µg/g CDW vs. 3.7 ± 0.1 µg/g CDW and 5.4 ± 0.2 µg/g CDW and 3.6 ± 0.2 µg/g CDW, respectively. In both cases (plasmid-free and plasmid-coded E. coli strains), the low δ-tocotrienol yields may be due to lower expression level of eukaryotic protein (Cyc-At) or its lower activity during in-vivo δ-tocotrienol biosynthesis. Another possible reason for conversion of MGGBQ into δ-tocotrienol may be the inaccessibility of Cyc-At proteins to the aromatic head group MGGBQ. Tocopherol cyclase (Cyc-At) protein were overexpressed in a His-tagged and a GST-tagged form in recombinant E. coli and purified. GST-tagged Cyc-At proteins showed higher enzyme activity compared to His-tagged Cyc-At (60.2 nmol/mg protein/h and 39.4 nmol/mg protein/h, respectively). Carbon flux in the direction of DXP pathway was increased, by integrating the Idi (isopentenyl diphosphate isomerase) expression cassette in ribose loci and enhancing the expression level of another rate limiting E. coli enzyme, Dxs (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase) by promoter exchange in the chromosome, to obtain E. coli CS8 and E. coli CS10 strains, respectively. As a result, MGGBQ yield increased by 1.4 and 2.4 times in E. coli CS8 and E. coli CS10 compared to that produced in E. coli CS6. Increased MGGBQ yields failed to increase the δ-tocotrienol yield in E. coli CS9 strain. In the current work, the shikimic acid pathway is not limiting, while the DXP pathway is. It is shown in this study that the plasmid-free system offers an optimal product yield as it reduces the metabolic burden which is otherwise exerted in case of plasmid-encoded system (carrying several copies of genes per cell) is used. Construction of plasmid-free system as shown in this study ensures the segregational stability of heterologous genes, unlike in plasmid-coded systems. Simple and efficient recombination methods followed in this work, to construct a heterologous host system in E. coli, has a potential in investigating more such complex natural product biosynthesis studies.
Vitamin E stellt eine Gruppe von fettlöslichen Verbindungen, bestehend aus jeweils vier Formen (δ,β,γ,α) der Tocopherole und Tocotrienole, dar. In der Natur werden „Vitamin-E-Verbindungen“ ausschließlich von Pflanzen und anderen photosynthetisch aktiven Organismen synthetisiert (mit der einzigen Ausnahme einer kürzlich entdeckten in einem nicht-photosynthetisch Plasmodium falciparum). δ-Tocotrienol ist eine seltene Vitamin E-Form im Gegensatz zu α-Tocopherol. α-Tocopherol, welches die höchste Antioxidationsaktivität der Vitamin E Verbindungen auf. Das δ-Tocotrienol wird hingegen als Wirkstoff in der Prävention und Behandung von Arteriosklerose, Alzheimer, Parkinson oder Krebs diskutiert. Menschen und Tiere können Vitamin-E-Verbindungen nicht selbst produzieren und müssen diese Substanzen somit durch die Nahrung aufnehmen. Um natürliche δ-Tocotrienol-Isomere herzustellen bedarf es komplexer, synthetischer Reaktionen oder der Gewinnung aus Pflanzen mittels Extraktion. Die Biotechnologie könnte mittels Metabolic Engineering einen wichtigen Betrag leisten, um den weltweit stetig steigenden Bedarf an δ-Tocotrienol zu decken. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Ansatz für die Biosynthese des aktiven δ-Tocotrienol-Stereoisomers und seiner Vorstufe 2-Methyl-6-geranylgeranyl-benzoquinol (MGGBQ) - mittels eines nicht-photosynthetisch aktiven, rekombinanten Stammes von Escherichia coli (E. coli) - untersucht. Um die Bildung von δ-Tocotrienol in E. coli zu realisieren, müssen vier Biosyntheseschritte, ausgehend von FPP und p-HPP, in E. coli etabliert werden. Hierzu wurden die Gene für die Hydroxyphenyl-Pyruvat-Dioxygenase (Hpd) aus Pseudomonas putida, die Geranylgeranylpyrophosphate Synthase (CrtE) aus Pantoea ananatis, die Homogentisat-Phytyltransferase (Hpt-Syn) aus Synechocystis sp. PCC6803 und die Tocopherol-Cyclase (Cyc-At) aus Arabidopsis thaliana mit Hilfe eines Expressionsvektors ausgeprägt. Für einen stabilen Produktionsprozess, ist ein Stamm mit einer stabilen Expressionsleistung über die gesamte Fermentationszeit notwendig. Ein Plasmidverlust während der Fermentation würde zum Verlust der heterologen Biosynthesegene führen und somit zu einer Verringerung der Produktivität. Zusätzlich der Einsatz von Antibiotika ist ein großer Kostenfaktor und zudem in der Lebensmittelindustrie unerwünscht. Um dieses Problem zu lösen, wurden in dieser Arbeit mittels homologer Rekombinationstechniken, plasmid-freie Stämme erzeugt, die δ-Tocotrienol und MGGBQ produzieren. Dazu wurden Expressionskassetten mit den Genen hpd, crtE, hpt-Syn und cyc-At erzeugt, die mittels des λ-Red-Rekombinase-Systems in die Loci der Zucker-Abbaugene für L-Fucose, Maltose, Lactose und D-Xylose ins Chromosom integriert wurden. Die erzeugten plasmid-freien und plasmid-tragenden Stämmen wurden in medium mit Glukose oder Glycerin als einziger Kohlenstoff- und Energiequellen kultiviert und die jeweiligen Ausbeuten an HGA, GGPP, MGGBQ und δ-Tocotrienol ermittelt und miteinander verglichen. Die hpd-Expressionskassette wurde in den L-Fucose-Locus des E. coli BW25113lacZ+ Stammes integriert und somit der Stamm E. coli CS1 erzeugt. Plasmid-tragende Stamm (E. coli BW25113/pCAS2JF) produzierte 1,6 fach mehr HGA als der plasmid-frei E. coli CS1 Stamm in Glukose-Medium (1213 ± 45 µg/l gegenüber 750 ± 34 µg/l) aber nur 0,6 fach in Glycerin-Medium (870 ± 69 µg/l vs 530 ± 43 µg / l). Die crtE-Expressionskassette wurde in den Maltose-Locus des E. coli LJ110 Stammes integriert und somit der Stamm E. coli CS2.1 erzeugt. Die GGPP Ausbeute bei dem E. coli CS2.1 stamm war höher als bei dem plasmid-tragenden E. coli-Stamm LJ110/pCAS30 (d.h. 310 ± 19 nmol / g CDW bzw. 249 ± 14 nmol / g CDW). Durch eine Decarboxylierungs und Prenylierungs-Reaktion zwischen HGA und GGPP wird MGGBQ gebildet. Diese Umsetzung wird durch das Enzym Hpt-Syn katalysiert. Die hpt-Syn-Expressionskassette wurde in den lactose-Locus des E. coli stammes integriert und somit der Stamm E. coli CS6 erzeugt. Die MGGBQ-Ausbeuten im E. coli CS6 unter Verwendung von Glukose betrugen 604 ± 24 µg/g CDW verglichen mit 325 ± 13 µg/g CDW im plasmid-tragenden Stamm (E. coli BW25113/pCAS29). Mit Glycerin als Kohlenstoffquelle erreichte der E. coli CS6 Stamm die MGGBQ-Ausbeuten von 669 ± 31 µg/g CDW verglichen mit 554 ± 29 µg/g CDW im E. coli BW25113/pCAS29 Stamm. Ein Grund für geringe MGGBQ-Ausbeute im plasmid-tragenden Expressionsystem ist die niedrigere segregationale Stabilität. Am Ende der jeweiligen Fermentationen enthielten ca. 50% (Glucose als Kohlenstoffquelle) bzw. ca. 40% (Glycerin als Kohlenstoffquelle) der Zellen keine Plasmide mehr. Wie HGA, MGGBQ oxidiert zu 2-Methyl-6-geranylgeranylbenzochinon (MGGBQ oxidiert) und wird durch eine Polymerisationsreaktion in ein braunes Pigment umgesetzt. MGGBQ wurde aus den E. coli CS6 Zellen isoliert und die chemische Struktur wurde durch Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie aufgeklärt. Die Tocopherol-Cyclase katalysiert die Ringschlussreaktion an der C1-Position des aromatischen Rings des MGGBQ zur Bildung von δ-Tocotrienol. Durch die chromosomale Integration der cyc-At Expressionskassette in den D-Xylose Locus des E. coli CS6 Stammes wurde der Stamm E. coli CS7 erzeugt. In Glukose-medium, wurde der E. coli CS7 Stamm produziert mehr MGGBQ als der plasmid-tragende Stamm E. coli BW25113/pCAS47. Im Glucose Medium wurden im E. coli CS7 Stamm Ausbeuten von 1581 ± 82 µg / g CDW erreicht. Der E. coli CS7 Stamm produziert mehr MGGBQ als der plasmid-tragende Stamm E. coli BW25113/pCAS47 (in Glukose-Medium 1581 ± 82 µg/g CDW verglichen mit 940 ± 32 µg/g CDW und in Glycerin-Medium: 1026 ± 23 µg/g CDW verglichen mit 346 ± 13 µg/g CDW). Die Umwandlung dieser MGGBQ-Mengen zu δ-Tocotrienol durch die rekombinante Tocopherol-Cyclase war im E. coli CS7 Stamm geringer im Vergleich zum E. coli BW25113/pCAS47. Somit konnten im E. coli BW25113/pCAS47 Stamm ca. 2,5-fach mehr Tocotrienol im Vergleich zum plasmid-freien E. coli-Stamm nachgewiesen werden. (Glukose-Medium: 9,4 ± 0,9 µg/g CDW verglichen mit 3,7 ± 0,1 µg / g CDW; Glycerin-Medium: 5,4 ± 0,2 µg/g CDW verglichen mit 3,6 ± 0,2 µg / g CDW). Diese Beobachtung könnte durch ein niedriges Expressionsniveau des eukaryotischen Cyc-At Proteins oder durch eine niedrigere Aktivität der rekombinanten Cyc-At im Stamm E. coli CS7 erklärt werden. Eine weitere Ursache für die niedrige Umwandlung von MGGBQ könnte die Unzugänglichkeit des Kohlenstoffatoms an der 1-Position des aromatischen Rings des MGGBQ sein. Um die MGGBQ-Ausbeute zu erhöhen, Kohlenstofffluss in Richtung der FPP-Bildung wurde erhöht. Eine zusätzliche idi (Isoprenyldiphosphat-Isomerase) Expressionskassette chromosomal in den D-Ribose-Locus des Stammes E. coli CS6 integriert (E. coli CS8), zum anderen wurde durch einen Promotoraustausch im Chromosom von E. coli CS8 die Expression des nativen dxs Gens verstärkt und somit der Stamm E. coli CS8 und E. coli CS10 wurde erzeugt. E. coli CS8 und E. coli CS10 zeigten 1,8 -und 2,4 - fach höhere MGGBQ-Ausbeuten im Vergleich zum E. coli CS6 Stamm. Jedoch führte die erhöhte MGGBQ-Ausbeute zu keinem signifikanten Anstieg in der δ-Tocotrienol-Ausbeute zum Beispiel im Vergleich mit dem E. coli CS9 Stamm (Cyc-At-Expressionkassette im Stamm E. coli CS8). In der vorliegenden Arbeit wurde für die Biosynthese von MGGBQ und δ-Tocotrienol in E. coli nachgewiesen, dass der Shikimisäure-Weg nicht limitierend ist, während dies für den DXP-Weg der Fall ist. Es wurde erfolgreich gezeigt, dass ein niedriges Niveau der heterologen Expression, bedingt durch die chromosomale Integration mit einer einzigen Kopie des Gens, ausreichend für eine effiziente heterologe in-vivo-Biosynthese von komplexen Naturstoffen wie dem lipophile MGGBQ und dem Tocotrienol ist. Durch die stabile Insertion der heterologen Gene ins Chromosom wird, im Gegensatz zur Verwendung von Plasmidvektoren, eine zuverlässige Weitergabe der Gene an die Tochterzellen gewährleistet. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse und molekularbiologische Rekombinationsmethoden zur Erzeugung heterologer E. coli Produktionsstämme bilden eine gute Ausgangsbasis um mittels biotechnologischer Methoden ähnlich bedeutende Naturstoffe herzustellen und vielleicht zukünftig dem Markt in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen.
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