Optimierung von Pseudomonas putida für die Produktion niedermolekularer Verbindungen

Abstract

Das Gram-negative Bakterium Pseudomonas putida ist aufgrund seines ausgeprägten Stoffwechsels für aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe in den letzten Jahren zu einem der wichtigsten Wirtsorganismen in der Biotechnologie geworden. Für die gezielte Manipulation seines Genoms stehen gentechnische Methoden zur Verfügung, die jedoch ineffektiv und nur schwer zu handhaben sind. Basierend auf der Toxizität des Antimetaboliten 5-Fluoruracil und der Wirkung der Uracilphosphoribosyl-Transferase wurde ein neues, effizientes Gegenselektionssystem für die Einführung genetischer Modifikationen etabliert. Damit konnte der Metabolismus von P. putida hinsichtlich der Produktion industrierelevanter Substanzen, wie Vanillin und Glyoxylsäure, erfolgreich beeinflusst werden. Unter Verwendung dieses Systems wurde der vollständig sequenzierte P. putida Stamm KT2440 für die Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin genetisch so modifiziert, dass mit ruhenden Zellen eine hohe Ausbeute und Produktivität erzielt werden konnte. Da die Deletion des Gens vdh für die Vanillin-Dehydrogenase nicht ausreichend war, um den Vanillin-Abbau zu verhindern, wurde mit dieser Mutante eine Transposonmutagenese durchgeführt. Hierbei führte die Inaktivierung des Gens modA, welches für einen Molybdat-Transporter codiert, zu einem Stamm, der nicht mehr auf Vanillin als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen kann. Durch zusätzliche Integration des starken tac Promotors konnte die Expression der chromosomalen Gene für die Feruloyl-CoA-Synthetase (fcs) und die Enoyl-CoA-Hydratase/Aldolase (ech) und damit die Umsatzrate von Ferulasäure zu Vanillin deutlich gesteigert werden. Weitere Optimierungen bezüglich geringerer Nebenproduktbildung führten zu einer molaren Ausbeute von bis zu 86% in nur 3 h. Dies stellt die höchste Produktivität dar, die bisher mit Pseudomonas Systemen beschrieben wurde. Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit für eine andere Arbeitsgruppe weitere Stämme konstruiert, mit denen Vanillin de novo aus Glucose bzw. Protocatechuat produziert werden soll. Um P. putida als Plattform für die Produktion von Glyoxylsäure aus Ethylenglycol zu etablieren, wurde der Metabolismus zweier P. putida Stämme, KT2440 und JM37, untersucht. Hierfür wurden in KT2440 verschiedene Gene deletiert und die erhaltenen Mutanten an andere Arbeitsgruppen übergeben, die auf dieser Basis weitere Analysen durchführen konnten. Hierbei konnten neben den Schlüsselenzymen auch Unterschiede zwischen den untersuchten Stämmen festgestellt werden. Während in JM37 die Expression der Gene für die Tartronatsemialdehydsynthase (gcl), Malatsynthase (glcB) und Isocitratlyase (aceA) durch Glyoxylsäure bzw. Ethylenglycol induziert wird, zeigt sich in P. putida KT2440 nur eine Induktion von aceA. Beide Stämme verwenden jedoch die periplasmatischen, Pyrrolochinolinchinon-abhängigen Dehydrogenasen PedE und PedH für den ersten Oxidationsschritt von Ethylenglycol. Mithilfe der erhaltenen Deletionsstämme konnte so der Ethylenglycol-Stoffwechselweg in P. putida aufgezeigt werden. Pseudomonas Stämme dienen neben Escherichia coli und Bacillus subtilis als Wirtsorganismen für die Produktion heterologer Proteine. Allerdings sind die bisher vorhandenen Expressionssysteme nicht so stark und gut reguliert wie in E. coli. Daher wurde ein neues, Methylethylketon-induzierbares Expressionssystem auf Basis der Promotorregion PmekA des mekAB Operons aus P. veronii MEK700 für P. putida und E. coli etabliert und charakterisiert. Der Transkriptionsstart von PmekA wurde bestimmt und dabei eine potentielle Stamm-Schleife-Struktur am 5’-Ende der mRNA entdeckt. Im Gegensatz zu etablierten Systemen zeigt das neue System Vor-teile hinsichtlich einer sehr niedrigen Basalexpression und einer hohen Induktions-rate. PmekA wird positiv durch MekR, einem Mitglied der AraC/XylS-Familie, reguliert. Die Expression unterliegt außerdem einer Katabolitrepression durch Glucose, wobei eine explizite Wirkung der globalen Regulatoren Crc und PtsN nicht beobachtet werden konnte. Da MekR nur in unlöslicher und damit inaktiver Form gewonnen werden konnte, wurde seine Bindestelle durch Sequenzanalysen näher charakterisiert. Durch den Vergleich mit bekannten Bindestellen anderer Mitglieder der AraC/XylS-Familie konnte der mutmaßliche Operator von MekR als eine Wiederholung der Sequenz CACCN5CTTCAA mit einer 6 bp langen Zwischenregion definiert werden. Modifikationen dieser Region bestätigten ihre Bedeutung für die Initiation der Transkription. Aufgrund der Lage des mutmaßlichen Operators, der mit der -35-Region überlappt, wird für PmekA eine Aktivierung der Klasse II vermutet.

The Gram-negative bacterium Pseudomonas putida emerged as a ‘working horse’ for the biotechnological industry due to its distinctive metabolism for aliphatic and aromatic compounds and several other advantages. Genetic methods for the directed manipulation of its genome are available. However, many of them are inefficient and often not easy to handle. Therefore, a negative counterselection system for P. putida based on the uracil phosphoribosyltransferase and the sensitivity against the antimetabolite 5-fluorouracil was developed, which allowed efficient and successive genetic modifications of the P. putida genome. Having this genetic tool at hand, the metabolism of P. putida could be efficiently affected concerning the production of industry relevant metabolites such as vanillin and glyoxylic acid. Using this counterselection system, P. putida strain KT2440 was genetically optimized to convert ferulic acid to vanillin using resting cells. Since the deletion of the vanillin dehydrogenase gene (vdh) was not sufficient to prevent vanillin degradation, a transposon mutagenesis was conducted with this strain. Inactivation of the modA gene coding for a molybdate transporter led to a strain incapable to grow on vanillin as sole carbon source. Biotransformation of ferulic acid to vanillin was further optimized by enhanced chromosomal expression of the structural genes for feruloyl-CoA synthetase (fcs) and enoyl-CoA hydratase/aldolase (ech). This was achieved by integration of the strong tac promoter system upstream of these genes. Further genetic engineering to reduce unwanted by-product formation led to high initial conversion rates and molar vanillin yields of up to 86% within just 3 h representing the highest specific productivity and molar vanillin yield gained with a Pseudomonas strain so far. Additionally, several strains were constructed in the context of this work for approaches of a de novo synthesis of vanillin out of glucose and protocatechuic acid conducted by another working group. In order to establish P. putida as a useful platform for the production of glyoxylic acid from ethylene glycol, the metabolism in the P. putida strains KT2440 and JM37 could be investigated after several genetic modifications with strain KT2440. These were conducted in the context of this work using the developed negative counterselection method. The subsequent analyses of the strains, conducted by other working groups, revealed the key enzymes and differences between the two strains. In JM37 expression of the genes for tartronate semialdehyde synthase (gcl), malate synthase (glcB), and isocitrate lyase (aceA) is induced in the presence of ethylene glycol or glyoxylic acid, while in KT2440 only aceA expression is induced. Both strains use similar periplasmic dehydrogenases for the initial oxidation step of ethylene glycol, namely, the two redundant pyrroloquinoline quinone dependent enzymes PedE and PedH. From these results a new pathway for the metabolism of ethylene glycol in P. putida could be identified. For the production of heterologous proteins, P. putida is regarded as an alternative host to Escherichia coli and Bacillus subtilis. However, expression systems are not as strong and well-regulated as in E. coli. Therefore, a new, methyl ethyl ketone (MEK)-inducible system based on the promoter region PmekA of the MEK degradation operon of P. veronii MEK700 was established and characterized in E. coli and P. putida. The transcriptional start site of PmekA was identified by primer extension, thereby revealing a potential stem-loop structure at the 5’-end of the mRNA. The system turned out advantageous over other established expression systems due to its extremely tight regulation accompanied by a three magnitudes fold increase of gene expression after treatment with MEK. It is positively regulated by MekR, a member of the AraC/XylS family of regulators, and is subject to carbon catabolite repression by glucose, which, however, could not be attributed to the single action of the global regulators Crc and PtsN. Since MekR was highly insoluble, its putative binding site was identified through sequence analysis. Taking known binding patterns of other members of the AraC/XylS family into consideration, the operator seems to be composed of a 15-bps tandem repeat (CACCN5CTTCAA) separated by a 6-bps spacer region. Mutational modifications of this region confirmed its importance for transcriptional activation. As the -35 promoter element seems to be overlapped by the putative operator, a class II activation mechanism is assumed.