Prozessdynamiken bei der Tryptophansynthese mit Escherichia coli

Abstract

Die energetische Effizienz bei der Verstoffwechselung von Kohlenstoff ist entscheidend für die Optimierung von biotechnologischen Produktionsprozessen. Während der Untersuchung von Dynamiken bei der L-Tryptophansynthese mit Escherichia coli wurden erhebliche Einflüsse der Wachstumslimitierungsstrategie auf die ATP- und Kohlenstoffeffzienz beobachtet. Für den L-Tryptophanproduzenten und einen Wildtypstamm konnte unter Phosphatlimitierung eine sinkende Energieladung beobachtet werden, obwohl die wachstumsunabhängige Glukoseaufnahme und Atmungsaktivität erhöht waren. Auf Basis von Transkriptomanalysen, Prozessbilanzierungen und Flussverteilungsanalysen sowie Vergleichen mit unabhängig veröffentlichten Studien zu ATP-stoffwechsel- und atmungskettende-defizienten Stämmen wurde eine vierstufiges Szenario zur Beschreibung der beobachteten Phänomene entwickelt. Eingeleitet durch eine Entkopplung des ATP-Synthasekomplexes (Stufe 1), wird die Effzienz durch modifzierte Atmungsaktivitäten weiter reduziert (Stufe 2). In der Folge kommt es zu Überflussreaktionen und Nebenproduktexport (Stufe 3), abschließend zu einer drastischen Reduktion der metabolischen Aktivität und zu Instabilitäten bis hin zum Zelltod (Stufe 4). Die Phosphatlimitierung hatte dabei Einfluss auf die initiale Entkopplung, weitere Effekte wurden durch sinkende Energieladung vermittelt. In diesem Zusammenhang könnten zusätzliche Energiesenken durch Produktsynthesen oder alternative Elementarlimitierungen mit Einfluss auf den Energiehaushalt weiteren Einfluss haben. Für Stickstofflimitierungen konnten ebenfalls Einflüsse auf die Kohlenstoffeffizienz beobachtet werden. Die reduzierte Effizienz hatte entscheidende Auswirkungen auf das Potential der L-Tryptophansynthese mit Escherichia coli. Zwar konnten durch Prozessoptimierung unter Verwendung des Modellstammes sowohl die Gesamtausbeuten (25%) als auch die volumetrische Produktivität (47 %) signifikant erhöht werden, das Potential weiterer Verbesserungen ist allerdings bedingt durch die niedrigen Energieladungen eingeschränkt. Zusätzlich hat die sinkende Energieladung regulatorischen Einfluss auf Schlüsselenzyme der L-Tryptophansynthese. Durch Flussverteilungsanalysen und Elementarmodenanalysen konnte gezeigt werden, dass bei verminderter Verfügbarkeit von ATP eine Reduktion der maximalen theoretischen Ausbeute um bis zu 60 % auftreten kann.

Energetic efficiency of the carbon metabolism is essential for the successful optimization of biotechnological productions. Within the framework of investigations of the L-tryptophan synthesis with Escherichia coli, significant impacts of the growth limitation strategy on ATP and carbon efficiency became evident. For an L-tryptophan producer and a wildtype Escherichia coli strain, a decreasing energy charge was observed during phosphate limitation. At the same time, growth independent glucose uptake and respiration were elevated. Data from transcriptome analysis, process balancing, flux balance analysis and independent studies of ATP-synthesis- or respiratory chain-deficient strains was used to develop a 4-stage scenario. Starting off with a potential influence on ATP-synthase efficiency (stage 1), decoupling is further increased by modified respiratory activity (stage 2) and byproduct overflow (stage 3) finally resulting in a metabolic breakdown entering complete phosphate depletion (stage 4). The decoupling is initiated by phosphate limitation, further effects are mainly mediated on metabolic level through ATP availability and energy charge. In this context, energy sinks triggered by product synthesis or alternative growth limitations could have an additional impact. Screening approaches revealed that carbon efficiency was also affected by nitrogen limitation. The observed reduced carbon efficiency had a critical impact on the potential of the L-tryptophan synthesis in Escherichia coli. Although, using the tryptophan producing model strain, the overall yield (25 %) as well as the volumetric productivity ( 47 %) could be improved significantly through process optimization, the potential of further improvement was limited. In addition to ATP limitation, the decreasing energy charge should mediate regulatory effects on essential enzyme activities. Under the given ATP limitation, flux balance analysis and elementary modes analysis revealed a significant reduction of the theoretical L-tryptophan yield.