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Authors: Müller, Ines
Title: Untersuchungen zum p53-NFκB cross talk in UV-bestrahlten humanen Keratinozyten
Other Titles: Analysis of p53-NFκB cross talk in UV irradiated human keratinocytes
Issue Date: 2015
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-102391
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/2387
http://dx.doi.org/10.18419/opus-2370
Abstract: Durch UVB-Bestrahlung von Keratinozyten wird DNA-Schaden induziert, der durch Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 die Apoptose stark geschädigter Zellen initiieren kann. Der Verlust von wtp53 kann somit zur malignen Transformation beitragen. Mutationen in p53 können zu einem gegenteiligen Effekt führen (gain-of-function) und die Tumorprogression sogar noch verstärken. Auch konstitutiv aktives NFκB wirkt pro-tumorigen und vermittelt z. B. Resistenzen gegenüber Chemotherapie. An welchen Punkten ein cross talk zwischen p53 und NFκB stattfindet, wird stark diskutiert. Mit Hilfe der spontan transformierten Keratinozytenzelllinie HaCaT konnte gezeigt werden, dass das Zusammenspiel von chronisch aktiviertem NFκB und mutp53 die UVB-induzierte Apoptose durch verstärkte TNF-Produktion nach IL-1-Stimulation erhöhte. Zum ersten Mal konnte über Chromatin Immunopräzipitation-Analysen nachgewiesen werden, dass nach Stimulation beide Transkriptionsfaktoren unabhängig voneinander an den humanen TNF-Promotor banden und dabei additiv zur TNF-Synthese beitrugen. In HaCaT-Zellen ohne intakten NFκB- und p53-Signalweg wurde folglich kein TNF mehr sezerniert und es konnte keine verstärkende apoptotische Wirkung von IL-1 mehr nachgewiesen werden. Wtp53 nahm keinen Einfluss auf die TNF-Sezernierung. Das Wildtypprotein band nicht an diesen Promotor, was zeigt, dass der cross talk von NFκB spezifisch mit mutp53 sattfindet. UVB-Strahlung führt dabei nicht nur zu einer aktivierenden Phosphorylierung von mutp53, sondern auch zur Inhibierung der katalytischen Untereinheit c der Serin-Threonin-Phoshatase PP2A. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass dadurch der negative Rückkopplungs-mechanismus von NFκB inhibiert ist, da eine kontinuierliche proteasomale Degradation von IκBα stattfindet. Diese verlängerte NFκB-Aktivierung ist für die TNF-Synthese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PP2A einen direkten Einfluss auf die Phosphorylierungsdauer und somit die Aktivierung von NFκB und CREB, der ebenfalls für die TNF-Transkription notwendig ist, nahm. In HaCaT-Zellen mit inhibierter PP2A waren diese beiden Modifikationen auch in unstimulierten Zellen nachzuweisen und die Transkriptionsfaktoren stellen somit zelluläre Ziele für die Phosphatase dar. Damit nimmt das Enzym einen äußerst wichtigen Stellenwert in der Regulation der TNF-Synthese ein. 4 % der Keratinozyten tragen Mutationen in p53, jedoch entwickeln sich deutlich weniger Zellen zum Hautkrebs. Da die humane Haut als einziges Organ ständiger UVB-Bestrahlung ausgesetzt ist und dies zur IL-1-Produktion führt, kann möglicherweise über den cross talk von NFκB und mutp53 der Organismus vor Hautkrebs geschützt werden. Diese Zellen könnten durch die verstärkte TNF-Sezernierung gezielt die Apoptose induzieren, während Zellen, die wtp53 exprimieren davon nicht betroffen wären. Zwei initial anti-apoptotische Faktoren, NFκB und mutp53, sind somit gemeinsam in der Lage eine pro-apoptotische Antwort zu generieren und zur Elimierung von Präkanzerosen in einem sehr frühen Stadium beizutragen.
UVB radiation induces DNA damage in human keratinocytes. Apoptosis can be induced in cells harboring irreparable DNA damaged by activation of the tumor suppressor p53 after UVB exposure. Loss of wtp53 function contributes to malignant transformation. Furthermore, p53 gain-of-function mutants result in the opposite wildtyp effect and can even enhance tumor progression. Constitutive NFκB activation is pro-tumorigenic and leads to resistance against chemotherapy. Still under debate is the point at which cross talk of these two transcription factors occurs. In the spontaneously transformed keratinocyte cell line HaCaT it was shown for the first time that chronically activated NFκB combined with mutp53 promotes apoptosis via cooperative TNF production in response to UVB+IL-1 treatment. After stimulation both transcription factors bind independently to the TNF promoter, shown by chromatin immunoprecipitation, and trigger additional TNF production. No secreted TNF or enhanced apoptotic response to IL-1 treatment could be detected in HaCaT cells without NFκB and p53 signaling pathways. Wtp53 does not affect TNF secretion. The wildtyp protein does not bind to the promoter, showing that the cross talk of NFκB is specific with mutp53. UVB does not only induce an activating phosphorylation of mutp53 but also an inhibition of the catalytic subunit c from the serin/threonine phosphatase PP2A. It was shown by our research group that this disrupts the negative feedback regulation of NFκB because IκBα is continuously degraded. The prolonged NFκB activation is essential for TNF synthesis. In the context of this work it could be shown that PP2A also directly influences the phosphorylation time and therefore the activation of NFκB and CREB, a transcription factor which is important for TNF transcription. Even in unstimulated HaCaT cells with inhibited PP2A both modifications were detected, indicating that these proteins are cellular targets of the phosphatase and PP2A is an important factor in the regulation of the TNF synthesis. 4 % of all keratinocytes harbor mutations in p53 but only a few cells develop skin cancer. As the human skin is the only organ which is constantly exposed to UVB radiation causing IL-1 production, the cross talk of NFκB and mutp53 might protect the human being from getting skin cancer. Other than wtp53 expressing cells, cells with mutp53 might induce apoptosis via enhanced TNF secretion. Two anti-apoptotic factors, NFκB and mutp53, are thus able to possibly generate pro-apoptotic responses which may serve as protective function to eliminate precancerous cells at an early stage.
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