Geminivirale Infektion in Interaktion mit DNA-Reparatur- und Schadenstoleranz

Abstract

Durch ihre Neigung zu Rekombinationen und Punktmutationen können sich Geminiviren schnell an neue Wirte und Umweltbedingungen anpassen und bedrohen so weltweit die Erträge wichtiger Nutzpflanzen. Die Vermehrung ihres zirkulären einzelsträngigen DNA-Genoms erfolgt über drei Replikationsmodi: complementary strand replication (CSR), rolling circle replication (RCR) und recombination-dependent replication (RDR). Geminiviren infizieren ausschließlich ausdifferenzierte Zellen und viele Arten bleiben auf kernhaltige Phloemzellen beschränkt. Da sie nur für wenige Proteine kodieren, ist ihre Replikation in erheblichem Maße von DNA-amplifizierenden und -modifizierenden Enzymen des Wirtes abhängig. Diese Arbeit befasst sich mit dem Zusammenspiel der geminiviralen Vermehrungsprozesse und verschiedenen Wegen der DNA-Schadenstoleranz und –Reparatur der Pflanze. Dafür wurden die Infektionen mit Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) und Cleome leaf crumple virus (ClLCrV) in knock-out- und Reporterlinien der Modellpflanze Arabidopsis thaliana analysiert. Die EuYMV-Infektion erhöhte die Häufigkeit der homologen Rekombination (HR) eines Reportertransgens speziell in Leitgewebe-assoziierten Zellen. Da EuYMV ausschließlich im Phloem nachgewiesen wurde, fördert die geminivirale Infektion vermutlich den HR-Reparaturweg der Wirtspflanze spezifisch in diesem Gewebe. Die Beiträge verschiedener HR-Faktoren zur geminiviralen Replikation, speziell der RDR, wurden durch biolistische Inokulationen von Wildtyp- und knock-out-Linien überprüft. Vielversprechende Schlüsselfaktoren des homologen Strangaustausches wie Rad51 oder Rad54 hatten keinen Einfluss. Das Rad51-Paralog Rad51D trug jedoch wesentlich zur geminiviralen Vermehrung bei, wahrscheinlich durch seine Funktion im HR-Reparaturmodus des single-strand annealing. Ku80, ein Schlüsselfaktor der fehleranfälligen non-homologous end-joining Reparatur, verzögerte den Verlauf der systemischen EuYMV-Infektion. Dieser hemmende Effekt könnte durch die Anhäufung fehlerhafter viraler DNA-Moleküle verursacht werden. Möglicherweise fungiert Ku80 außerdem als Sensor für virale DNA und löst durch die Interaktion mit der Exonuklease Wex eine pflanzliche Abwehrreaktion aus. Darüber hinaus wurde der Beitrag von Transläsionssynthese (TLS)-Polymerasen zur geminiviralen Replikation, speziell zur CSR, mittels biolistischer Inokulation sowie Insektenübertragung analysiert. Keine der TLS-Polymerasen war für die geminivirale Vermehrung notwendig. Jedoch deuten vergleichende Mutationsanalysen von EuYMV-Sequenzen erstmalig auf ihre Beteiligung und redundante Funktion bei der geminiviralen Replikation hin. Diese Ergebnisse lassen insgesamt die genetische Flexibilität der Geminiviren erkennen und könnten so ihre hohe Anpassungsfähigkeit und ihr epidemiologisches Potential erklären.

Phytopathogenic geminiviruses are prone to point mutations and recombination events. Thereby, they adapt quickly to new hosts and environments, threatening the yield of crop plants worldwide. Their circular single-stranded DNA genomes are propagated by three modes: complementary strand replication (CSR), rolling circle replication (RCR) and recombination-dependent replication (RDR). Geminiviruses exclusively infect differentiated cells and many species remain limited to nuclei-containing cells of the phloem. Since they encode only few proteins, their replication largely depends on DNA-amplifying and -modifying enzymes of the host. This study addresses the interaction of geminiviral amplification processes with DNA damage tolerance and repair pathways of the host plants. For this purpose, Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) and Cleome leaf crumple virus (ClLCrV) infections were monitored in knock-out and reporter lines of the model plant Arabidopsis thaliana. EuYMV infection enhanced homologous recombination (HR) rates of a transgenic reporter gene particularly in vein-associated cells. Since EuYMV was detected exclusively in phloem cells, it is likely that geminiviral infections promote the HR pathway specifically in this tissue. The role of distinct HR factors for geminiviral replication, especially for the RDR mode, was examined by biolistic inoculation of wildtype and knock-out lines. Promising key players of the homologous strand invasion reaction such as Rad51 and Rad54 had no impact. The Rad51 paralog Rad51D, however, promoted geminiviral amplification, probably due to its function in the HR mode of single-strand annealing. Ku80, a key factor of the error-prone non-homologous end-joining repair pathway retarded the progression of systemic EuYMV infection. The inhibitory effect might be caused by the accumulation of erroneous viral DNA molecules. Moreover, Ku80 might act as a viral DNA sensor and induce a defense response of the host plant due to its interaction with the exonuclease Wex. Furthermore, the contribution of translesion synthesis (TLS) polymerases to geminiviral replication, especially to the CSR mode, was analyzed by biolistic inoculation as well as insect transmission. None of the TLS polymerases was necessary for geminiviral amplification. However, comparative mutation analyses of EuYMV sequences imply their involvement and redundant function in geminiviral replication for the first time. Overall, these results indicate a high genetic flexibility of geminiviruses and may explain their high degree of adaptability and epidemic potential.