Lipase-katalysierte Synthese strukturierter Triglyceride: Verfahrensoptimierung und Erzeugung selektiver Lipasemutanten durch gerichtete Evolution

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die Lipase-Katalysierte Synthese strukturierter Triglyceride, zum anderen die Veränderung der Kettenlängenselektivität der slip1-Lipase aus C. rugosa durch gerichtete Evolution untersucht. Besonderes Interesse galt der Synthese von strukturierten Triglyceriden des ABA-Typs, die aufgrund ihrer symmetrischen Struktur zur Therapie von Fettabsorptionsproblemen wie z.B. Pankreasinsuffizienz eingesetzt werden können. Besonderes Interesse galt dabei der Synthese von 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerin (OPO), das in Säuglingsnahrung als Fettkomponente eingesetzt wird. Durch die Entwicklung eines Zweischrittverfahrens unter Berücksichtigung lebensmittelrechtlicher Aspekte gelang es, ABA-Triglyceride unter Verwendung von 1,3-regiospezifischen Lipasen in hoher Ausbeute und Reinheit zu synthetisieren. Die Zweischrittsynthese gliedert sich in eine Alkoholyse als ersten Reaktionsschritt, gefolgt von einer Veresterung im zweiten Reaktionsschritt. Das Zielprodukt der Alkoholyse, 2-MP, konnte durch Kristallisation sehr rein (> 95 %) mit einer Ausbeute von 82 % isoliert werden. Die regiospezifische Analyse mit Pankreaslipase ergab hochreines OPO mit 96 % Palmitinsäure in sn2-Position und 90 % Ölsäure in sn1(3)-Position. Im zweiten Teil der Arbeit wurde durch gerichtete Evolution die Kettenlängenselektivität einer synthetischen Lipase aus Candida rugosa verändert. Mittels error prone PCR wurde das slip1-Gen mutiert und durch Transformation in Saccharomyces cerevisiae in vivo recombiniert. Zur Identifizierung von gewünschten Mutanten wurde ein aus p-Nitrophenylestern unterschiedlicher Kettenlänge bestehender Assay entwickelt, wobei das durch Lipaseaktivität freigesetzte p-Nitrophenol bei 410 nm photometrisch detektiert wurde. Die selektierten sechs Klone wurden sequenziert und die Mutationen ausgewertet. Eine Mutante zeigte eine deutlich erhöhte Selektivität gegenüber Palmitinsäure und Stearinsäure im Vergleich zum Wildtyp.

Structured triglycerides of the ABA-type were synthesized with lipases by using a new two step process (alcoholysis and esterification). Symmetrical triglycerides are useful for patients with fat absorbtion problems. A special structured triglyceride 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglyceride (OPO) plays an important role in infant nutrition. The reaction parameters like solvent (only food grade solvent were used), water activity, temperature, lipase immobilisation were investigated. OPO was obtained in 64 yield and a purity of palmitic acid in sn2-position of 96 %. In the second part of the work the chain length selectivity of the lip1 gene from Candida rugosa were altered by directed evolution. One mutant has shown higher selectivity against palmitic acid and stearic acid in comparison to the wild type.