Proteinqualitätskontrolle des endoplasmatischen Retikulums: die zentrale Funktion der Ubiquitin-Protein-Ligase Der3/Hrd1p

Abstract

Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist diejenige Organelle eukaryoter Zellen, in der sekretorische Proteine ihre native Struktur einnehmen, posttranslatorisch modifiziert werden und ihren Weitertransport in Richtung Golgi-Apparat, Vakuole bzw. Lysosom, Plasmamembran und Extrazellulärraum antreten. Proteine, bei denen die Faltung nicht erfolgreich abgeschlossen werden kann, werden von einem System der Protein-Qualitätskontrolle erkannt, in das Zytosol rücktransportiert und vom Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Studien an dem eukaryoten Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae haben gezeigt, dass neben dem Sec61-Translokon, dem lumenalen Chaperon Kar2p und den Ubiquitin-konjugierenden (E2-) Enzymen Ubc1p, Ubc6p und Ubc7p am ER-Abbau u.a. die neu identifizierten Membranproteine Der1p, Der3/Hrd1p und Hrd3p beteiligt sind. Der3/Hrd1p fällt durch seine RING-H2-Finger-Domäne auf, einem Sequenzmotiv, dass bei einer Reihe von Ubiquitin-Protein-Ligasen (E3-Enzymen) angetroffen wird. Um entscheiden zu können, ob Der3/Hrd1p die Rolle eines solchen Enzyms innerhalb des ERAD-Systems übernimmt, wurde die exakte Membran-Topologie des Proteins bestimmt. Es durchspannt die ER-Membran sechs mal und der Carboxyterminus, einschließlich der RING-H2-Domäne, ist zum Zytosol hin orientiert. Es wurde gezeigt, dass Der3/Hrd1p in vivo an der Ubiquitylierung des Substrats Carboxypeptidase Y (CPY*) beteiligt ist und sich in vitro selbst ubiquityliert, jeweils in Abhängigkeit von einer funktionellen RING-Domäne. Diese Befunde sowie die RING-Finger-abhängige Bindung von Ubc7p an Der3/Hrd1p identifizieren Der3/Hrd1p eindeutig als die am ER-Abbauprozess beteiligte Ubiquitin-Protein-Ligase.

The endoplasmic reticulum (ER) contains a protein quality control system that recognizes malfolded or unassembled secretory proteins and subjects them to degradation in the cytosol. This requires retrograde transport of the respective proteins from the endoplasmic reticulum back to the cytosol via the Sec61 translocon. In addition, a fully competent ubiquitylation machinery and the 26S proteasome are necessary for protein retrotranslocation and degradation. In the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae, ubiquitylation of mutated and malfolded proteins of the ER is dependent mainly on the ubiquitin-conjugating enzyme Ubc7p. Furthermore, several new membrane components of the endoplasmic reticulum are required for degradation. Here, the topology of the previously discovered RING-H2-finger protein Der3/Hrd1p, one of the new components of the ER membrane, is presented. The protein spans the membrane six times. Both the amino-terminus and the carboxy-terminus containing the RING-H2-finger domain face the cytoplasm. RING-finger-dependent ubiquitylation of misfolded carboxypeptidase yscY in vivo as well as auto-ubiquitylation of Der3/Hrd1p itself in vitro are demonstrated. These results uncover Der3/Hrd1p as the ubiquitin-protein-ligase (E3) of the ER associated protein degradation process. In addition, RING-finger dependent binding of Ubc7p to Der3/Hrd1p is shown.