In vitro and in silico models for in vivo events

Abstract

In Part A the atrazine-specific scFv (single-chain variable antibody fragment) K411B, that can be applied in herbicide analysis, was expressed either in the cytoplasm or the periplasm of Escherichia coli BL21(DE3). For periplasmic production, the scFv was N-terminally fused to the pelB leader, whereas the unfused variant resulted in cytoplasmic expression. The expression level differed significantly: the extent of protein accumulation of the scFv with leader was 2.3 times higher than that of the protein without leader. To further investigate this, the respective translation profiles were generated by coupled in vitro transcription/translation assays and gave according results. Periplasmic expression resulted in only 10% correctly folded scFv. The same percentage was obtained when the scFv was expressed in vitro, indicating that the oxidizing environment of the periplasm did not increase proper folding. Thus, the data obtained in vitro confirmed the findings observed in vivo and suggested that the discrepancy in expression levels was due to different translation efficiencies. Enhanced green fluorescent protein (EGFP) was fused C-terminally to the scFv to allow online monitoring during the production process. The resulting fusion protein could be used in a novel fluorescence immunoassay referred to as fluorophor-linked immunosorbent assay (FLISA) in order to measure functionality of the fusion protein. The scFv domain, which binds to the immobilized hapten, can be detected by measuring the fluorescence of the EGFP domain. The time-consuming binding of secondary antibodies and enzyme reaction, necessary for ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays), is not required. Consequently, the assay time of 1.5 hours needed to complete the FLISA is much shorter than that of comparable ELISAs, which require about 5 hours. The amount of the soluble fraction of cell extracts from Escherichia coli expressing the fusion protein and the normalized fluorescence signal showed a linear correlation with R2 > 0.99. The FLISA was used to determine the amount of functional scFv-EGFP fusion protein expressed in E. coli. The fusion protein could not be expressed in the periplasm but in the cytoplasm and showed a similar expression profile as the scFv. In vitro, the expression with and without the pelB leader rendered the same production profile as for the scFv. This indicated that neither the translation efficiency nor the solubility but other factors impeded periplasmic expression of the fusion protein. In a high-cell-densitiy cultivation, 25 gramms (2 gramms per liter) of scFv were produced. As the major fraction of recombinant protein was insoluble, a refolding method was developed yielding active scFv in nearly quantitative yields. Alternatively, active scFv could be purified from the culture supernatant to homogeneity by immobilized metal affinity chromatography. When applied to s-triazine analysis, the FLISA performed with scFv-EGFP fusion protein showed better results than the respective ELISA using scFv. In Part B an assay based on molecular dynamics simulations for the prediction of substrate specificities of the IMP-1 metallo-b-lactamase and variants towards cephalosporin antibiotics was developed. To establish a reliable modeling method for the active site, containing two zinc atoms, a purely nonbonded approach and a cationic dummy atom approach were tested. The latter was shown to give a better representation of the protein. The enzyme in complex with a mercaptocarboxylate inhibitor as it had been crystallyzed could be simulated well with this procedure at 300 K. The active site, i.e. the coordination of the two zinc atoms remained stable. Subsequently, the model was successfully extended to the free enzyme and to the enzyme in complex with a b-lactam bound as an intermediate. In this structure the b-lactam is already hydrolyzed and coordinated to one zinc via the carboxylate, to the other zinc via the anionic nitrogen resulting from the amide bond cleavage. Cephalothin, a substrate that is known to be converted well, remained stable in the intermediate structure at 300 K for 1.2 ns. The zinc-zinc distances in the free enzyme and the enzyme in complex with the b-lactam intermediate differed significantly and suggest that upon catalytic conversion of the antibiotic a movement of the zinc atoms occurs. To investigate IMP-6, a mutant differing in one amino acid from IMP-1, and other b-lactam substrates, the molecules were docked into IMP-1 and IMP-6, respectively, according to cephalothin. For these enzyme/substrate combinations literature data (kcat/KM values) were available and these showed significant differences. As not all combinations remained stable in the intermediate structure at 300 K, molecular dynamics simulations were performed at 100 K. After several simulations had been carried out for each combination, three parameters proved to be correlated to the experimental data: 1. For combinations with very inefficient hydrolysis, the anionic nitrogen lost contact to the respective zinc, 2. a deformation of the angle between the anionic nitrogen, the dummy atom (a component of the cationic dummy atom approach) and the zinc atom was observed for combinations with poor conversion and 3. an increase of the zinc-zinc distance occurred in inefficient enzyme/substrate combinations. The mentioned angle and distance were related in each combination and when they were plotted versus each other in a 2D chart, a grouping of inefficient, middle-rate and efficient metallo-b-lactamase/b-lactam combinations was observed.

In Teil A wurde der Atrazin-spezifische scFv (single-chain variables Antikörperfragment) K411B, der in der Herbizid-Analytik eingesetzt werden kann, entweder im Zytoplasma oder im Periplasma von Escherichia coli BL21(DE3) exprimiert. Für die periplasmatische Produktion, wurde der scFv N-terminal mit einem pelB leader fusioniert, wohingegen die nicht-fusionierte Variante zu zytoplasmatischer Expression führte. Der Expressionslevel unterschied sich deutlich: der Grad an Proteinansammlung des scFv mit leader war 2,3 mal höher als der des Proteins ohne leader. Um diesen Sachverhalt weiter zu untersuchen, wurden die jeweiligen Translationsprofile durch gekoppelte in vitro Transkription-/Translations-Versuche erstellt und ergaben entsprechende Ergebnisse. Periplasmatische Expression ergab nur 10% richtig gefalteten scFv. Derselbe Anteil wurde erhalten, wenn der scFv in vitro exprimiert wurde. Dies zeigte, daß die oxidierende Umgebung des Periplasmas die Proteinfaltung nicht positiv beeinflußte. Folglich untermauerten die in vitro erhaltenen Daten die Beobachtungen in vivo und legten nahe, daß die Diskrepanz in den Expressionslevels die Folge unterschiedlicher Translationseffizienzen war. Verstärkt grün fluoreszierendes Protein (EGFP) wurde C-terminal an den scFv fusioniert, um ein "online monitoring" während des Produktionsprozesses zu erlauben. Das erzeugte Fusionsprotein konnte in einem Fluoreszenz-Immunoassay, fluorophor-linked immunosorbent assay (FLISA) genannt, eingesetzt werden, um die Funktionalität des Fusionsproteins zu messen. Die scFv-Domäne, die an das immobilisierte Hapten bindet, kann durch Fluoreszenzmessung der EGFP-Domäne detektiert werden. Das zeitraubende Binden von sekundären Antikörpern und die Enzymreaktion, die für ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays) notwendig sind, war nicht erforderlich. Deshalb ist die Assay-Zeit von 1,5 Stunden für den FLISA viel kürzer als die eines vergleichbaren ELISAs, der ungefähr 5 Stunden in Anspruch nimmt. Die Menge der löslichen Fraktion von Extrakten von E. coli Zellen, die das Fusionsprotein exprimierten und die normalisierte Fluoreszenz zeigten eine lineare Korrelation mit R2 > 0.99. Der FLISA wurde benutzt, um die Menge an funktionellem, in E. coli exprimiertem scFv-EGFP Fusionsprotein zu bestimmen. Das Fusionsprotein konnte nicht im Periplasma, aber im Zytoplasma exprimiert werden und zeigte ein ähnliches Expressionsprofil wie der scFv. In vitro ergab die Expression mit und ohne pelB leader das gleiche Produktionsprofil wie der scFv. Das deutete darauf hin, das weder die Translationseffizienz noch die Löslichkeit sondern andere Faktoren die periplasmatische Expression des Fusionsproteins verhinderten. In einer Hochzelldichte-Kultivierung wurden 25 g (2 g pro liter) scFv produziert. Da der größte Teil des rekombinanten Proteins unlöslich war, wurde eine Refolding-Methode entwickelt, die den scFv nahezu quantitativ in die aktive Form brachte. Alternativ konnte aktiver scFv aus dem Kulturüberstand durch immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie (IMAC) zur Homogenität aufgereinigt werden. In der s-Triazin-Analytik eingesetzt, zeigte der FLISA mit scFv-EGFP Fusionsprotein bessere Ergebnisse als der ELISA mit scFv. In Teil B wurde mit Hilfe von molekulardynamischen Simulationen ein Assay zur Vorhersage von Substratspezifitäten der IMP-1 Metallo-b-Lactamase und Varianten gegenüber Cephalosporin-Antibiotika entwickelt. Um eine verläßliche Modeling-Methode für das zwei Zinkatome enthaltende aktive Zentrum zu etablieren, wurde ein rein ungebundener Ansatz und ein kationischer Dummyatom-Ansatz ausprobiert. Letzterer gab das Protein besser wieder. Das Enzym im Komplex mit einem Mercaptocarboxylat-Inhibitor, so wie es kristallisiert worden war, konnte mit dieser Methode bei 300 K gut simuliert werden. Das aktive Zentrum, insbesondere die Koordination der beiden Zinkatome blieb stabil. Anschließend wurde das Modell erfolgreich auf das freie Enzym und das Enzym im Komplex mit einem b-Lactam in einer Zwischenstufe angewandt. In dieser Struktur ist das b-Lactam bereits hydrolysiert und zu einem Zink mit dem Carboxylat, zum anderen Zink mit dem anionischen Stickstoff, die durch die Hydrolyse der Amidbindung entstanden sind, koordiniert. Cephalothin, ein Substrat das gut umgesetzt wird, blieb in dieser Zwischenstufe bei 300 K über einen Zeitraum von 1,2 ns stabil gebunden. Die Zink-Zink-Abstände des freien Enzyms und des Enzyms im Komplex mit der b-Lactam-Zwischenstufe unterschieden sich deutlich and deuten darauf hin, daß während der katalytischen Umsetzung des Substrats eine Bewegung der Zinks stattfindet. Um IMP-6, eine Mutante, die sich in einer Aminosäure von IMP-1 unterscheidet, und andere b-Lactam-Substrate zu untersuchen, wurden die Moleküle entsprechend Cephalothin jeweils in IMP-1 und IMP-6 gedockt. Für diese Enzym/Substrat-Kombinationen waren Literaturdaten (kcat/KM -Werte) vorhanden, und diese wiesen deutliche Unterschiede auf. Da nicht alle Kombinationen bei 300 K in der Zwischenstufe stabil blieben, wurden die molekulardynamischen Simulationen bei 100 K durchgeführt. Nachdem mehrere Simulationen für jede Kombination durchgeführt worden waren, stellten sich drei Parameter heraus, die zu experimentellen Daten korreliert waren: 1. In Kombinationen mit sehr ineffizienter Hydrolyse verlor der anionische Stickstoff Kontakt zum entsprechenden Zink, 2. wurde eine Deformation des Winkels zwischen dem anionischen Stickstoff, dem Dummy-Atom (ein Teil des kationischen Dummy-Atom-Ansatzes) und dem Zink bei Kombinationen mit schlechter Umsetzung beobachtet, und 3. erfolgte eine Vergrößerung des Zink-Zink-Abstandes in ineffizienten Enzym/Substrat-Kombinationen. Der genannte Winkel und der genannte Abstand waren für jede Kombination voneinander abhängig und wenn sie in 2D-Diagrammen gegeneinander aufgetragen wurden, ergab sich eine Gruppierung in effiziente, mittelmäßig aktive und ineffiziente Metallo-b-Lactamase/b-Lactam-Kombinationen.