Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum: Variationen im Abbaumechanismus von löslicher und membrangebundener missgefalteter CarboxypeptidaseY (CPY*)

Abstract

Geregelter Proteinabbau ist eine Möglichkeit für eukaryontische Zellen Stoffwechselwege und Enzymaktivität zu regulieren. Dies ermöglicht ihnen Wachstum, Differenzierung und metabolische Adaption. Der Abbau nicht funktioneller oder falsch gefalteter Proteine schützt die Zelle vor Proteinablagerungen, die Zellfunktionen entscheidend stören und zur Entwicklung von Krankheiten, wie Alzheimer oder Parkinson, führen können. Eine wichtige Aufgabe ist hierbei die Kontrolle der Proteine, in Bezug auf ihre intakte Struktur, die für das sekretorische System bestimmt sind und ihren Wirkungsort im endoplasmatischen Retikulum (ER), dem Golgi Apparat, der Vakuole oder an der Plasmamembran haben. Alle diese Proteine unterzieht die Zelle nach dem Transport ins ER einer Qualitätskontrolle; falsch gefaltete Proteine werden zurückgehalten und dem Abbau über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System zugeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von drei unterschiedlichen Substraten verglichen, die von der Qualitätskontrolle im ER erkannt und dem Abbau zugeführt werden. Alle drei Substrate besitzen den gleichen, falsch gefalteten Proteinteil im Lumen des ER, die punktmutierte Carboxypeptidase yscY (CPY*). Es wurde untersucht, ob Komponenten der Abbaumaschinerie variieren, wenn an CPY* eine Transmembrandomäne (CPY*-Transmembrandomäne, Abk.: CT*) oder noch zusätzlich zur Transmembrandomäne das grün fluoreszierende Protein (GFP) als zytosolische Domäne angefügt wird (CPY*-Transmembrandomäne-GFP, Abk.: CTG*). Es konnte gezeigt werden, dass CT* und CTG* Typ I Membranproteine sind, deren N-terminale, CPY* enthaltende Teile glykosyliert werden und sich im ER-Lumen befinden, wohingegen deren C-terminale Teile im Zytosol lokalisiert sind. Aus früheren Arbeiten waren einige der zum Abbau von CPY* notwendigen Proteine bekannt. Es wurde deshalb untersucht, ob sie auch bei der Degradation von CT* und CTG* eine Rolle spielen. Es wurde festgestellt, dass CT* und CTG*, wie CPY*, über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut werden. Die Degradation beider Substrate ist in proteasomalen Mutanten verlangsamt. Ebenso sind zum Abbau die Ubiquitin übertragenden Proteine Ubc1p und Ubc7p zusammen mit der Ubiquitin-Ligase Der3/Hrd1p notwendig. Des Weiteren wurde gefunden, dass die AAA-ATPase Cdc48p benötigt wird. Dagegen wird Kar2p, ein Chaperon aus dem ER Lumen, nur für den Abbau von CPY* gebraucht, nicht jedoch für CT* und CTG*. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Ssa-Familie der zytosolischen Hsp70 Chaperone Einfluss auf den Abbau von CT* und CTG* ausübt. Es war bekannt, dass diese Chaperone nicht für den Abbau von löslichen Substraten benötigt werden. Es wurde gefunden, dass sie für die Degradation von CTG* essenziell sind, nicht jedoch für CT*. Die Chaperone sind vermutlich nötig, um die zytosolische GFP-Domäne in CTG* zu entfalten. Im Rahmen der Arbeiten zum Einfluss der AAA-ATPase Cdc48p auf den CPY* Abbau wurde festgestellt, dass eine Blockierung des Transportes vom ER zum Golgi einen Defekt im Abbau von CPY* zur Folge hat. Dies ist wahrscheinlich auf eine Reduzierung des ER oder die Misslokalisierung von Kar2p in diesen Transportmutanten zurückzuführen. Doppelmutanten, die Transportdefekte zwischen ER und Golgi aufweisen und gleichzeitig die Fähigkeit verloren haben, auf ungefaltete Proteine im ER zu reagieren, können CPY* praktisch überhaupt nicht mehr abbauen. Eine Haemagglutinin-Tag (HA) Version von CPY* wurde mit Hilfe von elektronenoptischen Aufnahmen in der Hefezelle lokalisiert. CPY* kann bei Blockade des Abbaus aus dem ER entkommen und findet sich dann im Golgi, der Vakuole und sezerniert im Medium. Diese Sekretion von CPY* konnte unabhängig hiervon auch biochemisch mit Hilfe von Immunodetektion bestätigt werden. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass die Vakuole zum Abbau von CPY* in Dder1 Zellen beiträgt. In Mutanten, die Defekte im Abbau von missgefalteten Proteinen aus dem ER aufweisen, wird die Morphologie des ER und Golgi verändert und der Transport von Wildtyp CPY durch das sekretorische System verlangsamt.

The endoplasmic reticulum (ER) is the folding compartment for proteins destined to operate in the secretory system. To ensure correct functioning of the secretory system, the folding process of newly synthesized proteins has to be monitored. Proteins, which do not reach their native conformation, have to be removed from the ER. To study the components necessary for degradation of soluble and membrane proteins, a set of misfolded proteins with CPY* as degradation motif was constructed. A transmembrane domain as well as a GFP (green fluorescent protein) tagged transmembrane domain was fused to the C-terminus of CPY* to generate CT* (CPY*-transmembrane domain) and CTG* (CPY*-transmembrane domain-GFP). CT* and CTG* are type one membrane proteins located in the ER. CT* and CTG* are unstable proteins. CT* has a half-life of 20 min, CTG* of almost 40 min at 30°C. Cycloheximide- and pulse chase experiments showed that CT* and CTG* share the same basic ERAD machinery with CPY*. Degradation is carried out by the proteasome after polyubiquitination by the E2s Ubc1p and Ubc7p together with the E3 Der3/Hrd1p. The degradation of CPY* depends on the ER lumenal chaperone Kar2p, whereas degradation of CT* and CTG* are independent of Kar2p. The Hsp70 Ssa-chaperone family in the cytosol is involved in the turnover of CTG*, but dispensable for CT* degradation. In yeast, there are more than 20 DnaJ-Proteins present. A decreased turnover of CTG* was found in three mutant strains, Dhlj1, Dygl128 and Dypr061. To confirm previous results of J. Bordallo, pulse chase experiments were performed to assess the stability of CPY* in Cdc48p mutants. This confirmed that Cdc48p is involved in the turnover of CPY*. In addition, overexpression of Cdc48p decreased the degradation of CPY*. Mutations in the complex partners Ufd1p and Npl4p of Cdc48p led to stabilization of CPY*, too. Degradation of CT* and CTG* depend also on Cdc48p. This indicates that the whole complex is generally involved in ERAD. Ufd3p, a protein of the so called ubiquitin fusion degradation (ufd) pathway, which is involved in ubiquitin homeostasis, is also necessary for CPY* degradation. The degradation of CPY* was analyzed in mutants defective in anterograde transport between the ER and Golgi. The mutant alleles sec12-1, sec23-1, ufe1-1, sed5-1 and sec18-1, which block vesicular ER to Golgi transport at restrictive conditions, were used to measure CPY* turnover. A defect in any of these proteins considerably reduces the degradation rate of CPY*. The half-life of CPY* increases about 2 (sec12-1, sec23-1 and sed5-1) to 6-7 (ufe1-1, sec18-1) fold in mutant cells compared to wild type. The degradation of CPY* was measured in yeast cells defective in Sec21p or Sec27p, two components of the COPI complex. Degradation of CPY* is only moderately affected in sec21-1 or sec27-1 cells at restrictive conditions. The localization of CPY* was analyzed by electron microscopy and immuno-gold visualization of an HA-tagged version of CPY*. CPY*-HA is localized to the ER/nuclear envelope and to the peripheral ER, whereas the later compartments of the secretory pathway are almost free of label in wild type cells. A yeast strain depleted of Der1p was used to analyze whether CPY*-HA is accumulating in a novel compartment. In Dder1 cells most of the CPY*-HA was found at the ER/nuclear envelope and the peripheral ER. CPY*-HA was also found in the Golgi apparatus and the vacuole. A fraction of CPY*-HA was secreted outside the cell. The localization of CPY* was also analyzed by Western blotting. In wild type cells a minor fraction of CPY* was secreted into the medium, whereas in Dder1 and Dder3/hrd1 cells more CPY* appeared in the medium. Pulse chase experiments were performed in cells with impaired vacuolar degradation due to deletion of the PEP4 gene, to analyze the fate of CPY* in the vacuole. The degradation of CPY* was the same in Dpep4 as in wild type cells. However, the degradation inDder1 Dpep4 double mutants was slower than in Dder1 single mutant cells. EM-images revealed that morphological changes are visible in ERAD deficient cells. In Dder1, Dder3/hrd1, Dhrd3 and der6-1 cells the Golgi apparatus appears as stacked cisternae in many cells compared to a typical wild type cell, which contains disconnected Golgi structures. Mutants defective in ER degradation (Dder1, Dder3/hrd1, Dhrd3 and der6-1) also exhibit a considerably proliferated ER. These morphological changes are absent in cells, where ER degradation is abolished in conjunction with the unfolded protein response. The transport of wild type CPY is not delayed to a significant degree in cells lacking Der1p. However, when CPY*-HA is expressed simultaneously with wild type CPY in Der1p deficient cells, the maturation of CPY from the p2CPY Golgi form to the mature vacuolar form is considerably delayed. Surprisingly, the exit of pro-CPY from the ER seems to be undisturbed.