Expression von DNA aus Bodenproben in Streptomyces für den Nachweis neuer Enzymaktivitäten

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Genbanken aus Boden DNA in Streptomyces erstellt und auf Enzymaktivität gescreent. In diesem Zusammenhang wurden anfänglich mehrere Reportergene in Streptomyces exprimiert und verschiedene Methoden zur Transformation von Streptomyces im Hinblick auf ihre Anwendbarkeit und Effizienz getestet und optimiert. Als geeignetste Transformationsmethode erwies sich die Protoplastentransformation. Mit dieser Methode konnten Transformationseffizienzen von 10 exp 6 cfu/ µg DNA in Streptomyces lividans erzielt werden und damit ausreichende Werte für die Herstellung von Genbanken erhalten werden. Nach Aufreinigung genomischer DNA aus Böden wurde eine mehr als 18500 Klone umfassende Genbank in Streptomyces lividans erstellt und auf Lipase- bzw. Esteraseaktivität getestet. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Gene für die Catechol-2,3-dioxygenase und die BTL2- Lipase, die in verschiedenen Schritten der Aufreinigungsprodzedur von Boden-DNA eingebracht wurden, in einem anschließenden Screening aufgefunden werden können. Durch das Wiederfinden dieser Gene wurde die Durchführbarkeit dieser Methoden demonstriert. So konnte die Catechol-2,3-dioxygenase in einem von 2200 gescreenten Kolonien und die BTL2- Lipase in zwei von 3000 gescreenten Kolonien nachgewiesen werden. Weiterhin wurde auf den Einsatz von Streptomyceten in verschiedenen Assaysystemen hingearbeitet, die eine Verwendung von Mikrotiterplatten zum Hochdurchsatz Screening erfordern. Es konnte gezeigt werden, daß Mikrotiterplatten im 96er und 384er Format, sowohl bei Verwendung des halbsynthetischen R5 Mediums für die Kultivierung von Streptomyces, als auch für die qualitative und quantitative Durchführung von Farbassays im Kulturüberstand geeignet sind.

It exists a great interest in industrial applicable enzymes, deriving from new sources. Out of this reason within the last years every effort was made to get access to new enzymes out of environmental samples. In this context mainly bacteria are of interest due to their high natural diversity. Since there are only 4000 bacteria characterized, it is assumed that more than 99.5 % are not cultivable and out of this not accessible to the classic methods for gaining new enzymes. The application of suitable methods for extraction and purification is in common considered as the best solution to tap the resources of microbial diversity . These methods should be able to extract the genomic DNA of all microorganisms within the soil sample. A further condition is that it should also remove traces of humic acids and heavy metals, in order to achieve good results in restriction, ligation and transformation of this DNA in suitable vectors and host organisms. E. coli as the most common bacterial host has proven difficulties in the functional expression of DNA from common soil bacteria like actionmycetes. Out of this reason as a further host organism beneath E. coli for the heterologous expression of genomic DNA from soil samples Streptomyces was chosen. The aim of this work was the production of gene libraries for the expression of soil DNA in Streptomyces and screening these libraries for enzyme activity. For the usage of Streptomyces as host organism for the expression of genomic DNA from soil several steps were performed. After suitable strains for transformation were selected, different transformation systems for Streptomyces were optimised due to an application for the transformation with soil DNA. For this purpose also several reporter genes were tested. With these optimised expression systems an agar plate screening for lipase and esterase activity was performed. In case for the test of other enzyme activities, e.g. epoxide hydrolyses, in which no suitable agar plate assays are available, alternative methods for the high throughput screening with Streptomyces should be developed. As a possible solution for this problem the cultivation of Streptomycetes in microtiter plates was examined.