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Autor(en): Yu, Xiaolei
Titel: Entwicklung eines diagnostischen DNS-Mikroarrays zur Genotypisierung der Chinolon-Resistenz von Escherichia coli
Sonstige Titel: Development of a diagnostic DNA-microarray to detect quinolone-resistance in Escherichia coli
Erscheinungsdatum: 2004
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-19638
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/795
http://dx.doi.org/10.18419/opus-778
Zusammenfassung: Chinolone gehören zu den leistungsfähigsten Antibiotika in der Humanmedizin. Die Resistenz gegen Fluorochinolone hat sich wegen des weltweiten Einsatzes dieses Medikaments schnell erhöht. E. coli ist eine der am meisten betroffene Spezies. Obwohl E. coli von Natur aus gegen Fluorochinolone sensitiv ist, wurde das Auftreten von E. coli Stämmen mit verringerter Empfindlichkeit gegen Fluorochinolone häufig beobachtet, besonders im Urinaltrakt-Bereich. Das vermehrte Scheitern von Behandlungen mit Fluorochinolonen ist darauf zurückzuführen. Die therapeutische Verwendung der Chinolone ohne Rücksicht auf eine mögliche Resistenz des Infektionserregers kann zu einem Behandlungsausfall sowie zu einer Induktion neuer Resistenzen führen. Ein schneller und präziser diagnostischer Resistenztest ist daher in der klinischen Anwendung von großer Bedeutung. Bis jetzt benötigen die Standardmethoden zur Detektion von Antibiotika-Resistenzen mehr als einen Tag. Durch die Verwendung der Mikroarray-Technologie kann die Testzeit in Zukunft bis auf wenige Stunden reduziert werden. Darüber hinaus kann die Detektion auf dem molekularen Niveau für die Überwachung von Patienten mit Langzeit-Antibiotikabehandlung und für die Untersuchung der Mechanismen von Resistenzen nützlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein diagnostischer Mikroarray zur Detektion von Punktmutationen entwickelt. Dieses Mikroarray-System kann die am weitesten verbreiteten Resistenzgenotypen von E. coli identifizieren. Anhand der Analyse von Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken sowie eigener Sequenzierungsdaten von klinischen Isolaten, wurden die Aminosäurepositionen 83 und 87 in der Untereinheit A der DNS-Gyrase (Gen gyrA) sowie die Aminosäurepositionen 80 und 84 in der Untereinheit A der Topoisomerase IV (Gen parC) als Mutationshotspots identifiziert. Die auf diese vier Positionen gerichteten Oligonukleotidsonden wurden so entworfen, dass sie sowohl die wichtigsten resistenzverursachenden Mutationen, als auch die assoziierten stillen Mutationen abdecken. Die Methode der Allel-spezifischen Hybridisierung wurde für den gyrA-Array und die Allel-spezifische primer extension für den parC-Array verwendet. Die Funktionsfähigkeit beider Arrays wurde mit 36 E. coli Isolaten aus vier unterschiedlichen Krankenhäusern in Deutschland validiert. Die Ergebnisse der Mikroarray-Analyse stimmten mit den Resultaten der direkten DNS-Sequenzierung und der phäntotpyischen Untersuchung überein. Um die Assayzeit zu reduzieren und die Sensitivität zu erhöhen, wurden die Markierungs-PCR und die Hybridisierung hinsichtlich dieser zwei Faktoren optimiert. Das optimierte Verfahren war in der Lage, die Resistenz von E. coli bis zu einer Konzentration von 100 CFU/ml (gyrA) bzw. 1000 CFU/ml (parC) nachzuweisen. Außerdem war die Identifikation von resistenten E. coli in Anwesenheit eines zehnfachen Überschusses an sensitivem E. coli möglich. Unter der Verwendung von Hybridisierungsstationen konnte die gesamte Testdauer auf 3.5 Stunden (gyrA) bzw. 4.5 Stunden (parC) reduziert werden. Nach der erfolgreichen Vereinigung des gyrA- und parC-Arrays konnten Mutationen in beiden Genen gleichzeitig nachgewiesen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte diagnostische Verfahren zur Bestimmung der Chinolonresistenz in E. coli bietet somit einen vielversprechenden Ansatz zur Verbesserung der Diagnostik von Infektionskrankheiten des Urogenitaltrakts und wird zukünftig mit der Entwicklung eines kommerziellen Prototyps fortgesetzt.
Quinolones are among the most potent antibacterial agents for use in human medicine. The resistance against fluoroquinolones has been increasing in accordance with the world wide use of this drug. E. coli is one of the most concerned species. Although E. coli strains are commonly susceptible to fluoroquinolones, it was observed, that the emergence of urinary-tract-derived strains with decreased susceptibilities to fluoroquinolones and fluoroquinolone treatment failures were associated. Therapeutic use of quinolones without considering the possible resistance of the infecting pathogen can lead to treatment failures as well as the induction of new resistances. A fast and precise diagnostic resistance test would be therefore of great value for the clinic. Up to now the standard methods to detect the antibiotic resistance take more than one day. Using microarray technology the test time can be shortened to a few hours. Besides this, the diagnostic on the molecular-level can be used for the monitoring of long time antibiotic treatment and for the investigation of resistance mechanisms. In this study, a diagnostic microarray for single base mutation detection was developed, which can readily identify the most prevalent E. coli genotypes leading to quinolone resistance. Based on sequence analysis using public databases and our own DNA sequencing results, two amino acid positions (83 and 87) of the A subunit of the DNA gyrase (gene gyrA) and two amino acid positions (83 and 87) of the A subunit of the topoisomerase IV (gene parC), have been identified as mutation hotspots and were selected for the DNA-microarray detection. Oligonucleotide probes directed against these four positions were designed, so that they could cover the most important, resistance causing and silent mutations. The allele-specific oligonucleotide probe hybridisation and allele-specific primer extension were used respectively for the gyrA and the parC array. The performance of both arrays was validated using 36 clinical isolates of E. coli from four different hospitals in Germany. The microarray results were confirmed by standard DNA sequencing and were in full agreement with the phenotypic antimicrobial susceptibility testing. In order to reduce the assay time and increase the sensitivity and specificity, the most important factors for a clinical application, the labelling PCR and array hybridisation were optimised. The optimised Assay was able to detect resistant E. coli in a concentration of 100 CFU/ml (gyrA) and 1000 CFU/ml (parC) respectively. Furthermore the identification of resistant E. coli in presence of a 10 fold excess of sensitive E. coli was possible. By using a hybridisation station the whole assay time could be reduced to 3.5 hours (gyrA) and 4.5 hours (parC) respectively. After the successful merging of the gyrA and parC array into a unified system, the mutations in both genes could be detected simultaneously. The diagnostic test developed in this study for the identification of quinolone resistances in E.coli offers therefore a promising approach for an optimisation of dianosis of urogenital tract infections and will be continued within a commecial prototype development in the near future.
Enthalten in den Sammlungen:03 Fakultät Chemie

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