The function of the beta6/Pre7 propeptide for 20S proteasome biogenesis in baker’s yeast

Abstract

In eukaryotes, the regulated proteolysis of intracellular proteins occurs through a specialized enzymatic machinery, the ubiquitin-proteasome system. Here proteins are specifically recognized and marked for degradation by addition of poly-ubiquitin chains before being degraded by the 26S proteasome. The 20S proteasome is the catalytic core of the 26S proteasome, composed of two copies of each 7 different alpha- and beta-type subunits forming a barrel-shaped complex. Assembly and maturation of the eukaryotic 20S proteasome is a multi-step process, in which the free alpha- and beta-type subunits are first assembled into the complete but still inactive complex. Final activation occurs after conversion of three of the beta-type subunits into their mature form by autocatalytic removal of N-terminal propeptides leading to the exposure of catalytic threonines at their N-termini. The contribution of the propeptides of these active beta-type subunits to particle assembly in baker's yeast ranges from absolute necessity to dispensability. In addition, of the four inactive beta-type subunits three are also synthesized with a propeptide which stays either unprocessed (beta-3/Pup3) or is only partially removed (beta-7/Pre4 and beta-6/Pre7) by the action of the activated neighbour beta-type subunits. The resulting short N-terminal extensions of 8-9 residues are found in the crystal structure of the yeast 20S proteasome in an extended conformation each reaching the restrictions separating the central proteolytic chamber from the antechambers. In this work multiple questions are addressed regarding the function of propeptides of the inactive subunits that have been preserved during proteasome evolution. The work focusses especially on the structure and function of the beta-6/Pre7 propeptide and its contribution to proteasome biogenesis, because it is essential for yeast cell viability in contrast to the beta-3/Pup3 propeptide that is dispensable for proteasome function, like already reported for the beta7/Pre4 propeptide. The region in the beta-6/Pre7 propeptide that is cleaved off by the neighboring active beta-type subunit beta-2/Pup1 is not essential, but the remaining 9 residues found in the mature proteasome are indispensable for its function. Stepwise truncation analysis in the Pre7 propeptide remnant region revealed that the six most C-terminal amino acids are sufficient for cell survival, but cell growth is considerably retarded if this piece is shortened from 9 to 6 residues. Surprisingly, the need for this propeptide remnant is restricted to the presence of the proteasome assembly factor Ump1. Ump1 was shown to enhance the dimerization of two half-proteasome precursor complexes and in addition to promote proteasome maturation. Fractionation of precursor and mature proteasome species by gel-filtration analysis as well as pulse-chase analysis elucidated that in a UMP1 wild-type strain background the Pre7 mutant bearing a propeptide remnant with 6 residues has severe defects in particle assembly and maturation. In contrast to this, in ump deletion cells such perturbation in assembly and maturation was found even in the presence of wild-type Pre7 and these defects were not enhanced by the truncations in the Pre7 propeptide region. Similarly, the proteasomal peptidase activities were reduced gradually along with stepwise truncations in the Pre7 propeptide region in the presence of Ump1, but the activity profiles were not altered in the ump1deletion strain background. As seen in non-denaturing gel electrophoresis, truncations in the Pre7 propeptide remnant region by up to 3 residues interfered with the dimerization of two half-proteasomes to the pre-holoproteasome and thus led to accumulation of these assembly products, but again only in the presence of Ump1. The obstruction stage in the proteasome assembly in those strains that are viable only in the absence of Ump1 was analysed by expressing the Ump1 protein from an inducible promoter. As expected, in cells carrying a Pre7 propeptide remnant shorter than 6 residues, the appearance of Ump1 completely inhibited their proliferation after few cell divisions. Analysis of these cells revealed that the proteasome assembly process is blocked at the state of half-proteasome assembly intermediates containing Ump1. Furthermore, interaction of Ump1 was restricted to the half-proteasome, whereas in strains carrying wild-type Pre7 Ump1 was found in a putative earlier assembly intermediate. Thus, the binding of Ump1 to early assembly stages might trigger the dimerization process more efficiently than its interaction with completely assembled half-proteasomes. In vitro interaction and GST-pull down analysis additionally indicated that formation of half-proteasomes is coupled with incorporation of Ump1 and that its association depends on the late incorporating subunits Pre2, Pre4 and Pre7, most likely mediated by their propeptides. Replacement analysis of the Pre7 propeptide remnant region showed that its function specifically depends on its amino acid sequence. Sequence comparison of the primary structure of beta-6 orthologues from different species enlightened that a proline at position -6 and a tyrosine at -5 have been absolutely conserved during evolution. In addition to this, a stretch of hydrophobic amino acids that forms a hydrophobic pocket and binds the propeptide in the mature proteasome was also found to be conserved in all known beta 6 subunits. The tyrosine at position -5 turned out to be crucial for the function of the Pre7 propeptide remnant, since its exchange with alanine was lethal in UMP1 wild-type cells. The aromatic side chain of this tyrosine is required to fix the propeptide remnant on the Pre7 subunit surface by interacting with the hydrophobic pocket, whereas the hydroxyl group is dispensable. Two phenylalanines in the hydrophobic pocket were also found to be essential, suggesting that these residues are either crucial to fix the propeptide at any stage of the assembly process or required for the structural integrity of the Pre7 subunit. Remarkably, the lethality caused by the mutations in the hydrophobic pocket was again coupled to the presence of the Ump1 protein. Probably, the exposure of this hydrophobic surface due to the absence of the Pre7 propeptide or due to loss of its ability to bind it might lead to unfavorable interactions of the Ump1 protein with this area and so might preclude further assembly and maturation steps. Although the propeptide of the Pre7 subunit seems to be crucial to avoid such unfavorable interactions of Ump1 with the hydrophobic surface, a primary role might lie in maintaining a structural integrity, which is a prerequisite for the proceeding of the assembly and maturation process. This is implicated by the fact that replacing the tyrosine in the propeptide region in combination with replacements of any of the hydrophobic amino acids in the hydrophobic pocket causes severe growth defects even in ump1 deletion cells and that exchanging all conserved residues in the pocket by alanines is lethal. Taken together this work establishes a critical role of Pre7 propeptide in the yeast 20S proteasome assembly and in its maturation. The conserved residues found in the propeptide and in the hydrophobic pocket of the Pre7 subunit are concertedly necessary for proper folding into a tertiary structure that allows efficient incorporation of the subunit into the proteasome. Moreover, the propeptide of Pre7 is specifically required for the function of the proteasome assembly and maturation factor Ump1 during proteasome biogenesis. In addition, it might be involved in interactions with other proteasomal proteins or in the transmission of structural alterations in the proteasomal assembly intermediates.

Regulierte Proteolyse von intrazellulären Proteinen findet in Eukaryonten über eine spezialisierte enzymatische Maschinerie statt, das Ubiquitin-Proteasomen-System. Dabei werden Proteine spezifisch erkannt und für ihren Abbau durch Anknüpfen von Poly-Ubiquitinketten markiert, bevor sie durch das 26S Proteasom zerlegt werden. Das 20S Proteasom ist die katalytische Kerneinheit des 26S Proteasoms und setzt sich aus zwei Sätzen von jeweils 7 verschiedenen alpha- und beta-Typ Untereinheiten zusammen, die einen fassförmigen Komplex aufbauen. Der Zusammenbau und die Reifung des eukaryontischen 20S Proteasoms ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem sich zunächst freie alpha- und beta-Typ Untereinheiten zu dem vollständigen, aber noch inaktiven Komplex zusammenlagern. Die Aktivierung geschieht abschließend mit der Überführung von drei der beta-Typ Untereinheiten in ihre reife Form durch die autokatalytische Entfernung von N-terminalen Propeptiden, was zur Freilegung von katalytischen Threoninen an deren N-Termini führt. Der Beitrag der Propeptide dieser aktiven beta-Typ Untereinheiten zur Assemblierung der Partikel reicht in der Bäckerhefe von absoluter Notwendigkeit bis zur Entbehrlichkeit. Weiterhin werden drei der vier nicht aktiven beta-Typ Untereinheiten ebenfalls mit Propeptid synthetisiert, welches entweder unprozessiert bleibt (beta-3/Pup3) oder nur partiell entfernt wird (beta-7/pre4 und beta6/Pre7), wofür aktivierte benachbarte beta-Typ Untereinheiten verantwortlich sind. Die resultierenden kurzen N-terminalen Verlängerungen von 8-9 Resten befinden sich in der Kristallstruktur der 20S Proteasoms von Hefe in einer gestreckten Konformation und reichen jeweils bis zu den Verengungen, welche die zentrale proteolytische Kammer von den Vorkammern abgrenzen. In dieser Arbeit werden mehrere Fragestellungen angegangen hinsichtlich der Funktion der während der Proteasomenevolution erhalten gebliebenen Propeptide von inaktiven Untereinheiten. Die Arbeit konzentriert sich besonders auf die Struktur und Funktion des beta-6/Pre7 Propeptids und dessen Beitrag zur Proteasomenbiogenese, da es essentiell für die Lebensfähigkeit von Hefe ist, im Gegensatz zu dem beta-3/Pup3 Propeptid, welches für die Proteasomenfunktion entbehrlich ist, wie auch bereits für das beta-7/Pre4 Propeptid beschrieben. Der Teil des beta6-/Pre7 Propeptids, der durch die benachbarte aktive beta Typ Untereinheit beta-2/Pup1 abgeschnitten wird, ist nicht essentiell, doch die 9 Reste, die im reifen Proteasom zu finden sind, sind unentbehrlich für dessen Funktion. Die Analyse von schrittweisen Verkürzungen des Propeptid-Überbleibsels ergab, dass die 6 am meisten C terminal gelegenen Aminosäuren ausreichend fürs Überleben der Zelle sind, jedoch ist das Zellwachstum beträchtlich verlangsamt, wenn dieses Stück von 9 auf 6 Reste verkürzt wird. Überraschenderweise ist die Notwendigkeit dieses Propeptid-Überbleibsels nur in Anwesenheit des Proteasomenassemblierungsfaktors Ump1 gegeben. Von Ump1 war bekannt, dass es die Dimerisierung von zwei Halbproteasomen-Vorläufern erleichtert und außerdem die Proteasomenreifung unterstützt. Die Fraktionierung von Vorläufer- und reifen Proteasomenformen durch Gel-Filtration sowie "pulse-chase"-Analysen deckten auf, dass im UMP1 Wildtyp-Stammhintergrund die Pre7-Mutante mit einem Propeptid-Überbleibsel von 6 Resten starke Defekte bei der Partikelassemblierung und dessen Reifung aufweist. Im Gegensatz dazu lassen sich in ump1Deletion Zellen solche Störungen des Zusammenbaus und der Reifung bereits in Gegenwart von Wildtyp-Pre7 feststellen, und diese Defekte werden durch Verkürzungen der Pre7 Propeptid-Restregion nicht weiter verstärkt. In ähnlicher Weise reduzieren sich die proteasomalen Peptidase-Aktivitäten bei Anwesenheit von Ump1 schrittweise mit zunehmender Verkürzung des Pre7 Propeptid-Rests, wogegen sich die Aktivitätsprofile im ump1 Deletion Stammhintergrund nicht verändern. Durch nicht-denaturierende Gel-Elektrophorese wurde ersichtlich, dass Verkürzungen des Pre7 Propeptid-Überbleibsels von bis zu 3 Resten mit der Dimerisierung von zwei Halb-Proteasomen zu Pre-Holoproteasomen interferieren und somit zur Anhäufung dieser Assemblierungsprodukte führen, jedoch wiederum nur in Anwesenheit von Ump1. Das Abbruchstadium in der Proteasomenassemblierung in solchen Stämmen, die nur in der Abwesenheit von Ump1 lebensfähig sind, wurde durch Expression von Ump1 von einem induzierbaren Promoter analysiert. Wie erwartet, inhibiert das Erscheinen von Ump1 die Zellvermehrung nach wenigen Teilungen vollständig in Zellen, die Pre7 Propeptid-Reste mit weniger als 6 Resten enthielten. Die Analyse dieser Zellen zeigte, dass der Prozess der Proteasomenassemblierung auf der Stufe von Ump1 enthaltenden Halb-Proteasomen-Assemblierungsintermediaten blockiert ist. Des weiteren war die Interaktion von Ump1 auf Halb-Proteasomen beschränkt, während in Stämmen mit Wildtyp-Pre7 Ump1 in einem wahrscheinlich früheren Assemblierungsintermediat zu finden war. Somit könnte die Bindung von Ump1 an frühe Assemblierungsstadien den Dimerisierungsprozess effizienter vorantreiben als seine Interaktion mit den vollständig assemblierten Halb-Proteasomen. Die Analyse von in-vitro Interaktionen und GST-„pull-down“-Experimente deuteten darüber hinaus an, dass die Bildung von Halb-Proteasomen mit dem Einbau von Ump1 einhergeht und dass dessen Assoziierung von den spät eingeführten Untereinheiten Pre2, Pre4 und Pre7 abhängig ist, sehr wahrscheinlich vermittelt durch deren Propeptide. Versuche zur Austauschbarkeit der Pre7 Propeptid-Restregion zeigten, dass deren Funktion spezifisch von seiner Aminosäurensequenz abhängt. Ein Sequenzvergleich der Primärstrukturen von beta-6 Orthologen aus verschiedenen Arten erhellte, dass ein Prolin an Position –6 und ein Tyrosin an Position –5 in der Evolution streng konserviert wurden. Zusätzlich dazu ließ sich in allen bekannten beta6-Untereinheiten eine konservierte Abfolge von hydrophoben Aminosäuren feststellen, die eine hydrophobe Tasche ausbilden und das Propeptid im gereiften Proteasom binden. Das Tyrosin an Position –5 stellte sich als bedeutsam für die Funktion des Pre7 Propetid-Überbleibsels heraus, denn sein Austausch durch Alanin war in UMP1 Wildtyp-Zellen letal. Die aromatische Seitenkette dieses Tyrosins wird benötigt, um den Propeptid-Rest durch Interaktionen mit der hydrophoben Tasche an der Oberfläche der Pre7-Untereinheit zu fixieren, während die Hydroxylgruppe entbehrlich ist. Zwei Phenylalanin-Reste in der hydrophoben Tasche wurde ebenso als essentiell identifiziert, was impliziert, dass diese Reste entweder wichtig sind, das Propetid in bestimmten Stadien des Assemblierungsprozesses zu fixieren oder für die strukturelle Integrität der Pre7-Untereinheit benötigt werden. Bemerkenswerterweise war die durch Mutationen in der hydrophoben Tasche verursachte Letalität wiederum an die Anwesenheit von Ump1 gekoppelt. Vielleicht führt die Exponierung der hydrophoben Oberfläche, bedingt durch das Fehlen des Pre7 Propeptids oder durch Verlust von dessen Bindefähigkeit, zu unzulässigen Interaktionen des Ump1 Proteins mit dieser Region, was weitere Assemblierungs- und Reifungsschritte ausschließen könnte. Obwohl das Propeptid der Pre7-Untereinheit kritisch dafür zu sein scheint, solche unerwünschten Interaktionen von Ump1 mir der hydrophoben Oberfläche zu verhindern, scheint eine primäre Rolle darin zu bestehen, die strukturelle Integrität zu bewahren, welche eine Voraussetzung für das Fortschreiten des Assemblierungs- und Reifungsprozesses ist. Dies wird durch die Tatsache impliziert, dass der Austausch des Tyrosins in der Propeptid-Region in Kombination mit Austauschen irgendeiner der hydrophoben Aminosäuren in der hydrophoben Tasche gravierende Wachstumsdefekte sogar in ump1Deletion-Zellen verursacht und dass das Ersetzen aller konservierten Reste der Tasche durch Alanine letal ist. Zusammengefasst belegt diese Arbeit eine kritische Rolle des Pre7 Propeptids in der Assemblierung und der Reifung des 20S Proteasoms in Hefe. Die konservierten Reste im Propeptid und in der hydrophoben Tasche der Pre7-Untereinheit sind gemeinsam notwendig für eine korrekte Faltung zu einer Tertiärstruktur, die einen effizienten Einbau der Untereinheit ins Proteasom gestattet. Darüber hinaus wird das Propeptid von Pre7 spezifisch für das Funktionieren des Proteasomenassemblierungs- und Reifungsfaktors Ump1 während der Proteasomenbiogenese benötigt. Weiterhin könnte es an Interaktionen mit anderen proteasomalen Proteinen oder an der Übertragung struktureller Veränderungen in proteasomalen Assemblierungsintermediaten beteiligt sein.