Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-8259
Authors: Weilbacher, Andrea
Title: Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren gegenüber unterschiedlichen p53 Aktivatoren
Other Titles: Role of the p53 status for tumor cell sensitivity towards different p53 activators
Issue Date: 2014
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-93130
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/8276
http://dx.doi.org/10.18419/opus-8259
metadata.ubs.bemerkung.extern: Die überarbeitete Version der Dissertation finden Sie unter http://dx.doi.org/10.18419/opus-9187.
Abstract: Die tumorsuppressiven Eigenschaften von p53 gelten als zentral bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Auf Grund dessen spielt p53 eine Schlüsselrolle bei der Reaktion auf genomischen Stress welcher unter anderem durch klassische Chemotherapeutika, wie beispielsweise Cisplatin, induziert wird. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle des p53-Status für die Sensitivität gegenüber p53-aktivierenden Substanzen untersucht. Hierfür wurde eine Auswahl von Zelllinien aus verschiedenen Entitäten und mit unterschiedlichen p53-Genotypen sowie Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren verwendet. Als p53-Aktivatoren wurden neben dem klassischen DNA-modifizierenden Molekül Cisplatin die direkten Aktivatoren von p53, Nutlin-3 und RITA eingesetzt. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen zu einem G1-Arrest. Dieser trat auch in primären, nichtmalignen Zellen auf. Nutlin-3 agiert somit selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen, nicht aber tumorselektiv. Die wtp53-selektive Wirkungsweise konnte weder nach Cisplatin- noch nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden. Beide Substanzen induzierten Zelltod auch in mtp53-Systemen oder im Falle von RITA auch in der p53-null-Zelllinie OVCAR5. Der durch Cisplatin und RITA induzierte Zelltod in der wtp53-exprimierenden Zelllinie NTERA-2D1 konnte auf die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Hingegen war der in den mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 induzierte Zelltod im Falle einer Behandlung mit Cisplatin oder RITA unabhängig von mtp53. Zudem führte die siRNA-vermittelte Depletion von p63 und p73 zu keiner Verminderung des Zelltods. Cisplatin und RITA können somit unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod in p53-defekten Systemen induzieren. Dieser war für beide Substanzen auf die Aktivierung der mitochondrialen Effektoren BAX und BAK zurückzuführen. Die Induktion von Zelltod nach Cisplatin-Behandlung konnte weiterhin auf die Aktivierung der pro-apoptotischen Bcl-2-Proteine NOXA und PUMA zurückgeführt werden. Die Analyse der konstitutiven Expression der Bcl-2-Proteine in der gesamten Zelllinienauswahl zeigte eine signifikante Korrelation des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gegenüber der Cisplatin-Sensitivität. NOXA und Bcl-w wurden in diesem Ansatz als prädiktive Marker der Cisplatin-Sensitivität innerhalb der Zellauswahl identifiziert. Die Kombinationsbehandlung von Cisplatin mit dem BH3-mimetic ABT-737 führte zu einer Sensitivierung von Cisplatin-insensitiven Zellen. Im Falle der Behandlung mit RITA konnte keine Korrelation zwischen dem Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen und dem durch RITA induzierten Zelltod festgestellt werden. Jedoch erwies sich die Herunterregulation von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen nach RITA-Behandlung als wichtig für die Induktion von Apoptose. Infolgedessen führte die Kombinationsbehandlung von RITA mit ABT-737 zu einer Verstärkung des RITA-induzierten Zelltods in RITA-sensitiven Zellen. RITA-insensitive Zellen blieben dabei unbeeinflusst. Weiterhin konnte der durch RITA vermittelte Zelltod in p53-defekten Systemen auf die Aktivierung des JNK- und p38-Signaltransduktionsweges zurückgeführt werden. Insbesondere JNK1 erwies sich als entscheidend für die Induktion von Apoptose nach RITA-Behandlung. Im Vergleich der drei Substanzen zeigte sich überraschenderweise eine größere Ähnlichkeit von RITA zu Cisplatin als zu Nutlin-3. Cisplatin, als klassischer über DNA-Schädigung wirkender p53-Aktivator, führte zur Induktion von Zelltod in Zelllinien welche nahezu alle auch sensitiv gegenüber der Behandlung mit RITA waren. Potentiell könnte somit auch RITA über DNA-Schädigungen Zelltod induzieren. Intrazellulär führen jedoch beide Substanzen zu unterschiedlichen Effekten. Während Cisplatin zu einer Hochregulation von pro-apoptotischen BH3-only-Proteinen führt, induziert die Behandlung mit RITA eine Reduktion anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine. Im Falle von Cisplatin konnte die Proteinkonzentration von NOXA und Bcl-w als Marker für die Sensitivität innerhalb der Zellauswahl identifiziert werden. RITA hingegen induzierte Zelltod nur in einer bestimmten Gruppe von Zellen, weshalb der Transport von RITA ein potentieller Marker für die RITA-Sensitivität darstellen könnte. Zusammenfassend konnte in der verwendeten Zellauswahl sowohl nach Nutlin-3-, als auch nach Cisplatin- oder RITA-Behandlung ein Einfluss von wtp53 für die Sensitivität nachgewiesen werden. Allerdings konnten durch Cisplatin und RITA auch Effekte unabhängig von p53 vermittelt werden. Interessanterweise führte die Behandlung mit RITA zu einer von der p53-Superfamilie und von der Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges unabhängigen Regulation von p53-Zielgenen. Dementsprechend können im p53-defekten System p53-Zielgene sowie typische p53-Funktionen durch die Aktivierung p53-unabhängiger Signalwege vermittelt werden.
The tumor suppressive functions of p53 are central for maintaining genomic stability. Due to this, p53 is a key player in the cellular response to genomic stress which is induced by classical chemotherapeutical agents such as Cisplatin. In this study the role of the p53 status for sensitivity towards p53 activating substances was investigated. Therefore, a panel of cell lines from different entities which includes all p53 genotypes was used. Additionally, tumor associated fibroblasts from lung cancer patients and PBMNCs from healthy donors were included in the study. As p53 activators the DNA modifying agent Cisplatin and the direct activators of p53 Nutlin-3 and RITA were used. Treatment with Nutlin-3 led to a selective activation of a G1 arrest in wtp53 expressing cells. This arrest was also observed in fibroblasts and PBMNCs. Consequently, Nutlin-3 acts selectively in cells carrying wtp53 but without being tumor selective. This wtp53 selective mode of action was not observed after Cisplatin or RITA treatment. Both agents induced cell death also in cells harboring mtp53. Furthermore, RITA treatment led to the induction of cell death in the p53-null cell line OVCAR5. As expected, the induced cell death after Cisplatin and RITA treatment in the wtp53 expressing cell line NTERA-2D1 was due to the activation of wtp53. In contrast, cell death induction after Cisplatin or RITA treatment in the mtp53-expressing cell lines OVCAR3 and OVCAR4 was not affected by silencing mtp53. Additionally, silencing of p63 and p73 did not reduce apoptosis after Cisplatin or RITA treatment. Thus, Cisplatin and RITA can act independently of the p53 superfamily in p53 defective systems. However, the induction of cell death after Cisplatin or RITA treatment in cells harboring defective p53 was due to the activation of the mitochondrial effector proteins BAX and BAK. Furthermore, the pro-apoptotic Bcl-2 proteins NOXA and PUMA were identified as mediators of cell death after Cisplatin treatment. Analyzing the constitutive expression of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins in the cell line panel a significant correlation between the ratio of pro- and anti-apoptotic proteins and the induced cell death after Cisplatin treatment was observed. Thereby, NOXA and Bcl-w could be identified a predictive markers for Cisplatin sensitivity in this cell line panel. Treatment of Cisplatin insensitive cells with Cisplatin and the BH3-mimetic ABT-737 lead to a sensitization these cells. A correlation between the constitutive expression of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 family proteins and the induced cell death after RITA treatment was not observed. However, the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 proteins after RITA treatment could be identified as an important step for induction of apoptosis. Therefore, treatment of RITA sensitive cells with RITA and ABT-737 led to a pronounced induction of cell death. RITA insensitive cells were not affected by this combinational treatment. Furthermore, the activation of the JNK and p38 signal transduction pathway in p53 defective cells could be identified as crucial for RITA mediated cell death. Especially JNK1 was essential to allow apoptosis development. Interestingly, the comparison of the three agents revealed that RITA exhibits a higher similarity to Cisplatin than to Nutlin-3. Cisplatin, which activates p53 via DNA-damage response mechanisms, induced cell death in cell lines which are almost all sensitive to RITA, too. This leads to the hypothesis that RITA might mediate cell death via induction of DNA damage. However, if so, RITA and Cisplatin seem to induce different DNA damage response mechanisms. While Cisplatin induces up-regulation of pro-apoptotic BH3-only proteins, treatment with RITA led to the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 proteins. In the case of Cisplatin, the protein levels of NOXA and PUMA were found to be predictive for sensitivity in the cell line panel. However, RITA induced cell death was limited to a specific group of cell lines. This indicates that differential RITA concentrations due to differential RITA transport might be responsible for this observation. Therefore, specific RITA transporters might serve as potential markers for RITA sensitivity. In conclusion, this study demonstrates that wtp53 can mediate the sensitivity towards Nutlin-3, Cisplatin and RITA treatment. However, in contrast to Nutlin-3, Cisplatin and RITA can also act independently of p53. Interestingly, p53 target genes were found to be regulated after RITA treatment independently of the p53 superfamily and the activation of the JNK signaling pathway. Accordingly, p53 target genes and typical functions of p53 can be mediated by the activation of p53 independent signaling pathways.
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