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Authors: Kandel, Benjamin
Title: Comparative analysis of the nuclear receptors CAR, PXR and PPARα in the regulation of hepatic energy homeostasis and xenobiotic metabolism
Other Titles: Vergleichende Analyse der Kernrezeptoren CAR, PXR und PPARα in ihrer Rolle als Regulatoren der hepatischen Energiehomöostase und des Fremdstoffwechsels
Issue Date: 2014 Dissertation
Abstract: Nuclear receptors (NRs), most notably the constitutive androstane receptor (CAR) and the pregnane X receptor (PXR), regulate the transcription of several drug metabolizing enzymes and transporters (DMET) and thus represent important regulators of drug metabolism in the liver. Accordingly, the ligand dependent activation of these NRs by drugs and other xenobiotics contributes to the intra- and inter-individual variability of the drug detoxifying system. CAR and PXR were further shown to regulate the transcription of key enzymes involved in lipid and glucose metabolism. The NR peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa), a key regulator of fatty acid catabolism and target of lipid lowering fibrates, was recently identified as a direct regulator of cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) and also potentially of other DMET genes. In this respect, CAR, PXR and PPARa are determinants of an overlapping number of liver functions including drug metabolism and energy homeostasis and are therefore associated with adverse drug reactions as well as liver disease like steatosis. Until now there have been no comparative studies investigating the transcriptomes of CAR, PXR and PPARa in humans. Therefore, a major focus of this study was to assess the genome-wide transcriptional changes provoked by these NRs in primary human hepatocytes (PHHs). To investigate human liver-specific gene expression and its regulation PHHs represent the most suitable available in vitro cell system. To identify the CAR-, PXR- and PPARa-specific genome-wide expression changes, hepatocyte cultures from six individual donors were treated with the prototypical ligands for CAR (CITCO), PXR (rifampicin) and PPARa (WY-14643) as well as DMSO (vehicle control). Afterwards, the mRNA expression in these samples was determined utilizing Affymetrix® microarrays. The obtained expression data were statistically evaluated to identify the genes that showed a differential expression in response to the agonist treatments and to investigate to which metabolic functions these genes contribute. The results of these experiments confirmed that CAR, PXR and PPARa regulated a highly overlapping but distinct set of genes coding for DMET. For example, according to KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway analyses expression of 10 DMET genes were shown to be regulated by all three NRs, whereas other DMET genes responded exclusively to the activation of one of the NRs. In addition several DMET related genes previously not shown to be regulated by CAR [like CYP2E1, sulfotransferase 1B1 (SULT1B1), UDP-glucuronosyltransferase 2B4 (UGT2B4) and cytochrome P450 reductase (POR)], PXR [like CYP2E1, alcohol dehydrogenases (ADHs), flavin containing monooxygenase 5 (FMO5) and glutathione peroxidase 2 (GPX2)] or PPARa like UBT2B4, ADH1s and FMO5) were identified to respond to the respective agonists. For PXR and CAR, this extends the list of genes by which these NRs influence drug metabolism and potentially contribute to drug-drug interactions (DDIs). The results obtained further specify the role of PPARa as a regulator of drug metabolism in vitro by increasing expression of, e.g., CYP3A4, 2B6, 2C8 and UGT1A1, thus pointing to a potential role of PPARa in adverse drug reactions in vivo. Furthermore, several genes coding for proteins involved in energy homeostasis, were identified as differentially expressed in response to PXR activation [e.g., pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4), glycogen synthase 2 (GYS2), carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT2)], where such a relation was not reported so far. These results further expanded the knowledge of how PXR potentially impact fatty acid catabolism, gluconeogenesis and lipid de novo synthesis and provide interesting starting points to investigate how PXR activation contributes to altered glucose and lipid levels or disease like hepatic steatosis. Besides ligand-dependent regulation of nuclear receptors, post-translational modification has also been shown to influence the activity of liver-enriched NRs and expression of their target genes. In this context, protein kinase A (PKA) had been shown to repress CYP3A4 expression via PXR in a species-dependent manner, whereas the influence of PKA on the expression of other DMET genes had not been investigated in detail so far. The second part of this work therefore investigated the impact of PKA activation on the expression and activity of important drug metabolizing enzymes in a PXR- as well as a CAR-dependent manner. In this work PKA activation in primary human hepatocytes was identified as a determinant of drug metabolism in vitro by repressing PXR- and CAR-mediated or reducing basal expression and activity of CYP1A1, CYP2B6, CYP2C8 and CYP3A4, but also expression of ATP-binding cassette B1 (ABCB1) and UGT1A1. Using reporter gene assays, these observed effects could be linked to PKA-mediated repression of PXR and CAR activity that may involve phosphorylation of these NRs. It could be further shown that expression of DMET genes was also repressed by the fasting hormone glucagon, a physiologically relevant activator of PKA signaling, which was not investigated in humans so far. Due to the promiscuous ligand-specificity of PXR, which includes numerous compounds, drug treatment often leads to PXR activation, even with so-called “natural” compounds like St. John’s wort (SJW). It would thus be highly desirable to develop strategies in drug development to assess or circumvent the activation of NRs without compromising the pharmacological effects. Therefore, the last part of this work consists of an in vitro study to investigate synthetic acylated phloroglucinols, designed as substitutes for hyperforin, regarding their potential to activate PXR. Hyperforin the major active constituent of the plant SJW used to treat depressions was shown to exert its antidepressant properties via indirect inhibition of serotonin reuptake by selectively activating the canonical transient receptor potential channel 6 (TRPC6). In addition, hyperforin is associated with clinically relevant drug-drug interactions in patients that had taken SJW concomitantly with other drugs due to potent activation of the nuclear receptor PXR by hyperforin. The phloroglucinol derivatives investigated in this thesis had previously been evaluated for their bioactivity. It had been reported that five of the nine synthetic acylated phloroglucinols activate TRPC6 with similar potency as hyperforin. In this work, all these nine synthetic phloroglucinol derivatives were investigated in comparison to hyperforin and rifampicin for their potential to activate PXR. Hyperforin and rifampicin treatment of HepG2 cells co-transfected with a human PXR expression vector and a CYP3A4 promoter reporter construct resulted in potent PXR-dependent induction, while all TRPC6-activating compounds failed to show any PXR activation or to antagonize rifampicin-mediated CYP3A4 promoter induction. Hyperforin and rifampicin treatment of primary human hepatocytes resulted in highly correlated induction of PXR target genes, whereas treatment with the phloroglucinol derivatives elicited moderate gene expression changes that only weakly correlated to those of rifampicin treatment. The herein observed lack of PXR activation by the TRPC6 activating phloroglucinols was further supported by in silico pharmacophore modeling that did not indicate potent agonist or antagonist interactions for the TRPC6 activating derivatives and docking studies that suggested interaction of only one of these compounds. These in silico studies performed by Prof. Sean Ekins are published together with the results presented in this work (Kandel et al., 2014). This approach shows that strategies avoiding PXR activation are conceivable in drug development in order to prevent DDIs and improve drug safety. Taken together, these results further increase the number of genes by which CAR, PXR, and PPARa contribute to the regulation of drug metabolism and energy homeostasis. Moreover it was demonstrated that the PKA, which is involved in the transduction of the effects of, e.g., the hormone glucagon, represents a determinant of the drug detoxifying system in humans. Furthermore, a strategy could be presented, taking the example of the hyperforin derivates, which can be used to investigate and avoid DDIs in drug development. Such information will become imperative in future personalized medicine and the ever-present polypharmacy in order to handle intra- and inter-individual variability and to minimize drug failure or drug-drug interactions.
Kernrezeptoren, allen voran der Constitutive Androstane Receptor (CAR) und der Pregnane X Receptor (PXR), regulieren die Transkription zahlreicher Arzeimittel- metabolisierender Enzyme und Transporter (engl. drug metabolizing enzymes and transporters / DMET) und stellen damit wichtige Regulatoren der Entgiftungs-prozesse in der Leber dar. Folglich trägt die Liganden-abhängige Aktivierung dieser Rezeptoren, durch Arzneimittel und andere körperfremde Stoffe, zur intra- und inter-individuellen Variabilität des Arzneimittelstoffwechsels bei. CAR und PXR sind zudem in die Regulation des Fett- und Glukosestoffwechsels involviert. Auch für den Kernrezeptor Peroxisome Proliferator-activating Receptor Alpha (PPARa), ein Schlüsselregulator des Fettsäure-Abbaus und Ansatzpunkt von Fibraten, wurde kürzlich gezeigt, dass dieser die Expression von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) direkt reguliert und darüber hinaus mit der Regulation weiterer wichtiger DMET-Gene assoziiert ist. In diesem Zusammenhang stellen CAR, PXR und PPARa wichtige Determinanten von Leberfunktionen wie Arzneimittel-Metabolismus und Energie-homöostase dar und stehen dadurch in Verbindung mit Arzneimittelnebenwirkungen, sowie Lebererkrankungen, wie beispielsweise Steatose. Bis jetzt gibt es keine vergleichenden Studien, welche die Transkriptome der Kernrezeptoren CAR, PXR und PPARa im Menschen untersucht haben. Deshalb war ein Hauptaspekt dieser Arbeit, die genomweiten transkriptionellen Veränderungen, welche durch diese Kernrezeptoren in humanen Leberzellen hervorgerufen werden, zu untersuchen. Diese Untersuchungen wurden mit primären humanen Hepatozyten durchgeführt, da diese Zellen das geeignetste verfügbare Zell-Modell zur Untersuchung der leberspezifischen Gen-Expression und deren Regulation darstellen. Um die CAR-, PXR- und PPARa-spezifischen, genomweiten Expressions-änderungen zu bestimmen, wurden Hepatozyten-Kulturen von sechs verschiedenen Spendern mit den prototypischen Liganden für CAR (CITCO), PXR (Rifampicin) und PPARa (WY-14643), sowie mit DMSO, der Vehikel-Kontrolle, behandelt. Im Folgenden wurde die mRNA-Expression in diesen Proben mittels Affymetrix® Microarrays bestimmt. Die Expressions-Daten wurden statistischen Analysen unterzogen, um die Gene zu identifizieren, die eine signifikant veränderte Expression durch die Agonisten-Behandlungen zeigten; des Weiteren wurde untersucht, mit welchen metabolischen Funktionen diese Gene assoziiert sind. Die so gewonnenen Resultate bestätigten, dass CAR, PXR und PPARa unterschiedliche, aber dennoch teilweise überlappende Gruppen von DMET-Genen regulieren. Durch KEGG- (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway-Analysen wurde beispielsweise gezeigt, dass eine Gruppe von zehn DMET-Genen gleichermaßen durch CAR, PXR und PPARa reguliert wurden, wohingegen die Expression weiterer DMET-Gene exklusive durch die Aktivierung einer der drei Rezeptoren beeinflusst wurde. Für eine Reihe dieser Gene wurde hierbei eine Regulation durch die Rezeptoren CAR [z.B. CYP2E1, Sulfotransferase 1B1 (SULT1B1), UDP-Glucuronosyltransferase 2B4 (UGT2B4) und Cytochrom P450 Reductase (POR)], PXR z.B. CYP2E1, Alkohol Dehydrogenasen (ADHs), Flavin-abhängige Monooxygenase 5 (FMO5) und Glutathion Peroxidase 2 (GPX2)] und PPARa [z.B. UBT2B4, ADH1s und FMO5] erstmals gezeigt. Für CAR und PXR erweitert dies die Liste der Gene, durch welche diese Kernrezeptoren den Arzneimittel-Metabolismus beeinflussen und potenziell zu Arzneimittelwechsel-wirkungen beitragen. Die erhaltenen Daten konkretisieren darüber hinaus die Funktion von PPARa als Regulator von DMET-Genen in vitro, beispielsweise durch eine Erhöhung der Expression von CYPs 3A4, 2B6, 2C8 und UGT1A1. Dies lässt auch auf eine Beteiligung von PPARa bei Arzneimittelnebenwirkungen in vivo schließen. Des Weiteren zeigten die Analysen, dass Gene, wie beispielsweise Pyruvat Dehydrogenase Kinase 4 (PDK4), Glycogen Synthase 2 (GYS2) und Carnitin Palmitoyltransferase 2 (CPT2), deren Proteine an der Energiehomöostase beteiligt sind, in Folge einer PXR Aktivierung differenziell exprimiert wurden. Ein solcher Zusammenhang war für diese Gene bisher unbekannt. Diese Resultate erweitern die bestehenden Kenntnisse der potenziellen Mechanismen über die PXR Stoffwechselprozesse wie Fettsäure-Abbau, Glukoneogenese und de novo Lipogenese beeinflusst und somit PXR zu Veränderungen von Lipid- und Glukose-Spiegeln oder Erkrankungen wie hepatischer Steatose beitragen kann. Neben einer Liganden-abhängigen Regulation von Kernrezeptoren wurde auch für post-translationale Modifikationen gezeigt, dass diese Einfluss auf die Aktivität von Kernrezeptoren und deren Zielgen-Expression nehmen. So wurde für die Proteinkinase A (PKA) eine Repression der CPY3A4 Expression, als Folge einer PXR-Phosphorylierung, gezeigt. Ein Einfluss der PKA auf die Expression anderer humaner DMET-Gene hingegen ist bislang kaum untersucht. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich daher mit der Untersuchung des Einflusses einer PKA-Aktivierung auf die Expression und Aktivität von Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen, in Abhängigkeit von PXR und dessen nächstverwandtem Kernrezeptor CAR. In dieser Arbeit wurde durch qRT-PCR Analysen der mRNA-Expression und CYP-Aktivitätsmessungen, mittels eines Cocktail-Assays, in primären humanen Hepatozyten gezeigt, dass eine PKA-Aktivierung durch 8-bromo cAMP eine Determinante des Arzneimittelstoffwechsels in vitro darstellt. Diese Analysen zeigten eine Repression der CAR und PXR vermittelten, sowie der basalen Expression und Aktivität von CYP1A1, CYP2B6, CYP2C8 und CYP3A4 als auch der Expression von ATP-binding cassette Transporter B1 (ABCB1) und UGT1A1. Reporter-Gen Experimente zeigten zudem, dass die beobachteten Effekte in Verbindung mit einer erniedrigten PXR- und CAR-Aktivität standen. Des Weiteren wurde aufgezeigt, dass die Expression von DMET-Genen auch durch das Hormon Glucagon, ein physiologisch relevanter Aktivator des PKA-Signalweges, reprimiert wurde, was bisher in dieser Form noch nicht untersucht worden war. Auf Grund der breiten Liganden-Spezifität von PXR führen Behandlungen mit Arzneimitteln, sowie mit sogenannt „natürlichen“ Heilmitteln wie Johanniskraut, oft zu einer unerwünschten PXR-Aktivierung. Diese PXR-Aktivierung und die dadurch hervorgerufene veränderte Expression und Aktivität von DMET stehen im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Arzneimittelnebenwirkungen. Solche Arzneimittelnebenwirkungen sind auch für Johanniskraut-Präparate beschrieben, die auf den potenten PXR-Agonisten Hyperforin zurückzuführen sind. Hyperforin, die stärkste aktive Komponente der Johanniskrautpflanze, welche zur Behandlung von Depressionen verwendet wird, vermittelt seine antidepressive Wirkung über eine selektive Aktivierung des TRPC6-Kanals und in Folge dessen eine Inhibierung der Serotonin-Wiederaufnahme. Zur Vermeidung solcher Arzneistoffnebenwirkungen wäre es daher von großem Vorteil, wenn bei der Arzneimittelentwicklung Strategien zur Verfügung ständen, mit denen man eine PXR-Aktivierung verhindern könnte, ohne den pharmakologischen Effekt zu beeinträchtigen. Als Beispiel für eine solche Strategie wurde im letzten Teil dieser Arbeit eine in vitro Studie durchgeführt, um synthetische, acylierte Phloroglucinole, welche als Ersatzstoffe für Hyperforin entwickelt wurden, auf ihr PXR-Aktivierungspotential im Vergleich zu Hyperforin und Rifampicin, hin zu untersuchen. Eine frühere in vitro Studie konnte bereits zeigen, dass fünf dieser synthetischen acylierten Phloroglucinole einen mit Hyperforin vergleichbaren pharmakologischen Effekt besitzen. Eine Hyperforin- und Rifampicin-Behandlung von HepG2 Zellen, die mit einem Expressions-Vektor für humanes PXR, sowie einem CYP3A4-Reporter-Konstrukt transfiziert waren, resultierte in einer potenten PXR-abhängigen Induktion des CYP3A4-Promotors, während die TRPC6-aktivierenden Substanzen keine PXR-Aktivierung und CYP3A4-Promotor Induktion zeigten. Die Behandlung von primären humanen Hepatozyten mit Hyperforin und Rifampicin führte zu einer stark korrelierenden Induktion von PXR-Zielgenen; die Behandlung mit den Phloroglucinol-Derivaten hingegen rief nur moderate Expressions-Änderungen hervor, welche nur schwach mit den durch Rifampicin-Behandlung vermittelten Effekten korrelierten. Das in dieser in vitro Studie beobachtete Fehlen einer PXR-Aktivierung durch die TRPC6-aktivierenden Phloroglucinole wurde weiter unterstützt durch die im Rahmen einer Kooperation von Prof. Ekins durchgeführten in silico Pharmakophor-Modellierungen und Bindungsstudien, die nur schwache Interaktionen der TRPC6-aktivierenden Derivate mit PXR vorhersagten (Kandel et al., 2014). Diese Herangehensweise zeigte, dass Strategien mit dem Ziel, eine PXR-Aktivierung zu untersuchen und diese zu vermeiden, einen denkbaren Ansatz bieten, um in der Arzneimittelentwicklung dem Auftreten von Arzneimittelwechselwirkungen vorzubeugen und damit die Sicherheit von Medikamenten zu verbessern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der hier präsentierten genomweiten Studie an humanen Hepatozyten zahlreiche neue Zielgene der NRs CAR, PXR und PPARa identifiziert wurden, welche zu einer Beeinflussung des Arzneimittelstoffwechsels und der Energiehomöostase durch diese NRs beitragen könnten. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die PKA, die unter anderem die Effekte des Hormons Glucagon vermittelt, eine Einflussgröße für die Arzneimittelentgiftung im Menschen darstellt. Des Weiteren wurde am Beispiel von Hyperforin-Derivaten eine Strategie präsentiert, die zur Untersuchung und Vermeidung von Arzneimittel-interaktionen in der Medikamentenentwicklung beitragen kann. Im Hinblick auf die personalisierte Medizin und die allgegenwärtige Polypharmazie werden solche Informationen in Zukunft unerlässlich sein, um Probleme, die durch intra- und interindividuelle Variabilität hervorgerufen werden, zu berücksichtigen und um das Auftreten von Therapieversagen und Arzneimittelwechselwirkungen zu minimieren.
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