Oxidationsreaktionen mittels der Cytochrom P450-Monooxygenase CYP102A1 in Enzymreaktoren

Abstract

Biokatalytische Prozesse werden im Rahmen der Ausrichtung der chemischen Industrie hin zu nachhaltigen und ressourcenschonenden Produktionsverfahren zunehmend in die Praxis übertragen. Die enzymatische Darstellung chiraler Alkohole wird bisher vor allem durch die Reduktion prochiraler Ketone unter Verwendung von Alkoholdehydrogenasen bewerkstelligt. Einen alternativen Zugang zu chiralen Alkoholen und Epoxiden erlauben Oxygenasen. Deren häufigste Vertreter mit 4600 bekannten Sequenzen sind Cytochrom P450-Monooxygenasen (CYPs), die in der Lage sind, Sauerstoff mit teilweise sehr hoher Regio- und Stereoselektivität in nicht aktivierte C-H-Bindungen einzuführen bzw. C-C-Doppelbindungen zu epoxidieren. CYPs werden zur Zeit industriell ausschließlich in Form von Ganzzelbiokatalysatoren eingesetzt. Die Verwendung isolierter CYPs in der organischen Synthese hingegen wurde bisher als nicht praktikabel erachtet, da für die enzymatische Aktivität in den meisten Fällen mehrere Elektronentransportproteine sowie der teure Kofaktor Nicotinamidadenindinucleotid(phosphat) (NAD(P)H) benötigt werden. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit des Einsatzes isolierter Varianten von CYP102A1 in der präparativen organischen Synthese untersucht werden. Grundvoraussetzung für den Einsatz eines Enzyms in der Biokatalyse ist seine effiziente und damit kostengünstige Produktion. Zur Steigerung der Ausbeute bei der rekombinanten Expression von CYP102A1 in Escherichia coli BL21 (DE3) wurde zunächst ein neuer Vektor (pET28a+CYP102A1) konstruiert. In diesem System konnten Expressionsausbeuten von 144 mg CYP102A1 pro Liter Kulturmedium erreicht werden. Durch die Expression als Fusionsprotein mit einer Hexahistidinsequenz konnte eine zeitsparende einstufige Aufreinigungsmethode für CYP102A1 entwickelt werden. Ein großes Problem bei der Etablierung zellfreier, durch P450-Monooxygenasen katalysierter Prozesse ist die Abhängigkeit der Enzymklasse vom Kofaktor NAD(P)H. Da der Ersatz des Kofaktors NADPH durch Wasserstoffperoxid oder der Einsatz von Riboflavin als Elektronenüberträger nicht die für präparative Anwendungen nötigen Umsatzraten lieferte, wurde die Regenerierung von NADPH mittels einer NADP+-abhängigen Formiatdehydrogenase (FDH) untersucht. Dieses Kofaktorregenerierungssystem erwies sich als geeignet, durch CYP102A1 katalysierte Reaktionen über Tage aufrechtzuerhalten. Als Modellreaktionen für die weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen wurden die Hydroxylierung von Cyclohexan, Oktan und Myristinsäure sowie die Epoxidierung von Styrol gewählt. Da noch keine Varianten von CYP102A1 bekannt waren, die die Substrate Cyclohexan und Styrol mit hoher Umsatzrate oxidieren, wurden Varianten von CYP102A1 hinsichtlich ihrer Aktivität in diesen Reaktionen charakterisiert. Herausragendes Ergebnis auf diesem Gebiet ist einerseits die annähernd stereospezifische Epoxidierung von Styrol zu R-Styroloxid (92% ee) durch CYP102A1 F87G. Andererseits konnte die Variante CYP102A1 R47L/Y51F identifiziert werden, die die mit einer Bindungsdissoziationsenergie von 90 kJ/mol äußerst stabile CH-Bindung in Cyclohexan spalten und durch eine Hydroxylgruppe ersetzen kann. Im nächsten Schritt wurden verschiedene Reaktionssysteme für die durch CYP102A1-Varianten katalysierte Reaktion untersucht. Ein Ansatz war dabei die Erzeugung eines heterogenen Katalysatorystems durch Einschluss von CYP102A1 und FDH in einer in situ gebildeten Sol-Gel-Matrix. Durch diese Immobilisierung des Biokatalysators konnte seine Lagerstabilität um eine Größenordnung erhöht werden. Alternativ wurde ein zweiphasiges Reaktionssystem entwickelt, welches an Hand der Hydroxylierung von Cylohexan optimiert wurde. Unter Verwendung dieses Ansatzes konnte Cyclohexanol im Grammmaßstab synthetisiert werden. Um die allgemeine Anwendbarkeit des Zweiphasensystems für CYP-katalysierte Hydroxylierungs-reaktionen zu demonstrieren, wurde die Umsetzung von n-Oktan und Myristinsäure untersucht. Auch in diesen beiden Fällen konnten präparative Mengen der hydroxylierten Produkte isoliert werden. Weiterhin konnte in diesem zweiphasigen Reaktionssystem auch die Epoxidierung von Styrol durchgeführt werden, wobei 4.4 g reines Styroloxid isoliert werden konnten. Bei der Epoxidierung von Styrol erhöhte der Einsatz von statistisch methyliertem -Cyclodextrin zur Erhöhung der Löslichkeit des organischen Substrats in der wässrigen Biokatalysatorphase die Ausbeuten. Auch Myristinsäure kann durch Verwendung von statistisch methyliertem -Cyclodextrin in einer Konzentration von 10 g l-1 in der Reaktionsmischung gelöst werden, was für eine Hydroxylierungsreaktion in homogener wässriger Lösung genutzt wurde. Dabei wurden für die eingesetzte CYP102A1-Variante maximale Zykluszahlen (ttn) von 50600 erreicht.

The properties of CYP102A1 (P450 BM-3) from Bacillus megaterium render this enzyme a promising candidate for developement of cell-free hydroxylation and epoxidation reactions: The activity of this natural fusion protein comprising a CYP heme domain and an FAD- and FMN-containing oxidoreductase domain does not depend on additional electron transfer proteins. Due to this domain organisation electron transfer to the heme iron is fast, enabling high hydroxylation rates (>1000 min-1) for the fatty acid substrates. Application of enzymes in biocatalysis depends on an efficient and cost-effective system for heterologous enzyme production. This problem was targeted by construction of the vector pET28a+CYP102A1, allowing for heterologous expression of CYP102A1 in E. coli BL21 (DE3) cells. As a result expression levels of 144 mg CYP102A1 per litre could be obtained. In the next step, methods for replacement or regeneration of the cofactor NADPH were investigated. Replacement of NADPH by hydrogen peroxide, directly leading to the catalytically active iron-oxo species in the CYP catalytic cycle gave poor turnover rates amounting only 3 % of the turnover rate obtained with the natural cofactor. Riboflavin, which can be reduced by electrochemical, photochemical or chemical means, could be shown capable of transferring electrons to the CYP102A1 heme domain. However turnover rates were even lower than with hydrogen peroxide, amounting roughly 1 % of the rates obtained when using the cofactor NADPH. The use of genetically engineered formate dehydrogenase (FDH) from Pseudomonas sp. 101 (EC 1.2.1.2), which is capable of oxidising formate to carbon dioxide and in turn reduces NADP+ to NADPH, is most promising. This reaction can be efficiently coupled to the NADPH-dependent oxidation activity of CYP102A1. After this efficient regeneration method for the reduced cofactor NADPH was found, different reaction systems were compared. Immobilisation of CYP102A1 in a sol-gel matrix derived from tetraethoxyorthosilicate (TEOS) tremendously improved the enzyme's storage stability (half-life of 29 days at 25°C in sol-gel-matrix compared to only 2 days in potassium phosphate buffer). The sol-gel-immobilised enzyme was used for the hydroxylation of octane, naphthalene and ionone on analytical scale. Despite the improvement in storage stability, the operational stability of the immobilised enzyme was lower than that of the enzyme in solution. Highest operational stability was found when CYP102A1 was applied directly as E. coli cell extract. Therefore other reaction systems were assayed, resulting in developement and optimisation of a biphasic system for hydroxylation of cyclohexane and octane and for epoxidation of styrene. Myristic acid was most efficiently hydroxylated in a homogeneous solution applying randomly methylated cylodextrine for solubilisation of the substrate. For hydroxylation of cyclohexane a CYP102A1 mutant catalysing this reaction had to be found. A screening of several mutants revealed that CYP102A1 R47L/Y51F hydroxylates cyclohexane at a rate of 14 min-1. Compared to the wildtype, this is a 20-fold improvement in activity. Using this mutant the hydroxylation of cyclohexane coupled to cofactor regeneration by FDH in a biphasic reaction system (cyclohexane / aqueous biocatalyst system) was optimised. Finally the reaction was performed in a reactor applying constant aeration, online pH- and oxygen partial pressure (pO2) measurement. Product concentration in this setup increased for almost 140 h. Extraction of the reaction product revealed a total turnover number (ttn) of 12800 in this system. Epoxidation of styrene was performed using CYP102A1 F87G. In a mutant screening this variant displayed a epoxidation rate of 34 min-1 and an enantiomeric exess of 92% R for the reaction product styrene oxide. The reaction in a biphasic styrene / aqueous buffer system was optimised. A ttn of up to 18000 for CYP102A1 F87G could be reached using 35 mM randomly methylated cyclodextrine for substrate solubilisation. However upon uscaling to 2 l-scale the ttn decreased to 6700. Still 4.4 g of >90 % pure styrene oxide could be distilled from the reaction mixture. Further experiments showed that an aqueous solution containing 20 mM randomly methylated cyclodextrine can dissolve myristic acid at 10 g l-1. This finding was used for hydroxylation of myristic acid in homogeneous aqueous solution. In this reaction the triple mutant CYP102A1 A74G/F87V/L188Q (hydroxylating myristic acid with a turnover rate of > 1000 min-1) was applied in combination with FDH. In this system the ttn finally reached 50600.