Subcellular localization and molecular interactions of phosphoinositide 5'-phosphatases of the yeast synaptojanin-like protein family

Abstract

Phosphorylated derivates of phosphatidylinositol, collectively called phosphoinositides (PIs), are a minor class of short-lived lipids that control numerous cellular processes including cell signaling, growth, vesicular traffic, and actin cytoskeletal arrangements. Different PI isoforms are concentrated in distinct subcellular compartments, with for example phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] at the plasma membrane and PtdIns(4)P on Golgi membranes. PIs also play a role in the mechanism by which the direction of membrane traffic is controlled. To guarantee the proper vesicle formation and targeting to the acceptor compartment, the differential distribution of PIs is maintained by specific PI kinases, which localize to specified subcellular compartments. Conversely, a set of phosphatases and lipases regulates the PI turnover. Previous studies implicated de-phosphorylation of PtdIns(4,5)P2 by the mammalian polyphosphoinositide phosphatase synaptojanin 1 as an important step in endocytosis. Since then, indirect evidence exists in different model organism for a role of the synaptojanin proteins in the un-coating of clathrin-coated endocytic vesicles. Members of the highly conserved synaptojanin family are defined by a three-domain structure. The N-terminal domain, homologous to yeast Sac1p, exhibits in some family members polyphosphoinositide phosphatase (PPIP) activity that can hydrolyse the phosphate at the 3', 4', or 5' position of the inositol ring. The central PI 5'phosphatase (5-Pase) domain specifically hydrolyses the phosphate at the 5' position of PtdIns(4,5)P2. The C-terminal proline-rich domain is more variable among the different family members. The yeast Saccharomyces cerevisiae contains three synaptojanin-like (Sjl) proteins, Sjl1p, Sjl2p, and Sjl3p. All three family members exhibit 5-Pase activity, while only Sjl2p and Sjl3p possess the PPIP activity. While previously Sjl1p has not been assigned to vesicular transport, Sjl3p has been implicated in clathrin-mediated membrane traffic between the TGN and endosomes. Since less data existed about the function of Sjl2p, the work of this thesis focused on further evidence for a specific role of Sjl2p in clathrin-mediated endocytosis. Initially, in this PhD thesis evidence was provided for an association of each family member with filamentous actin assembled in vitro. However, Sjl1p seems to be associated with F-actin more tightly than Sjl2p and Sjl3p. As already described above, earlier studies provided evidence for a localization and function of the three yeast synaptojanin family members at distinct subcellular compartments. To identify specific Sjl2p-binding partners, GST-pulldown assays and co-immunoprecipitation experiments were performed. GST-pulldown assays using the proline-rich domain of Sjl2p revealed the association of the following proteins: the putative endocytic vesicle scission factor Rvs167p, the early endocytic protein End3p, and, most importantly, clathrin heavy chain (Chc1p), the major component of clathrin-coated vesicles. Although most likely transiently, Sjl2p seems to be part of the Sla1p/Pan1p complex. Sla1p and Pan1p are multivalent proteins, which bind to a variety of endocytic proteins and thereby regulate the progress of early steps of endocytosis. In yeast, the question was still unresolved whether the synaptojanin-like proteins are associated with clathrin-coated vesicles (CCVs). Sephacryl S-1000 gel filtration chromatography resulted in co-fractionation of Sjl2p and Sjl3p with clathrin-coated vesicles, while Sjl1p eluted with the main peak of the cytoplasmic phosphoglycerate kinase and actin, well separated from vesicles. Although the immunodetection of Sjl2p with CCVs was unsuccessful by electron microscopy, several lines of evidence from this thesis and recently published work support the idea that Sjl2p resides on endocytic CCVs. Sjl3p is likely associated with CCVs derived from the TGN. An emerging body of evidence indicates that posttranslational modifications play a key role in the most, if not all, cellular processes in eukaryotes. The activity of a variety of plasma membrane transporters, channels, and receptors is regulated by internalization via the endocytic machinery. The internalization is initiated by phosphorylation and/or the attachment of an ubiquitin moiety to specific amino acid residues. In S. cerevisiae, phosphorylation of trans-acting proteins is one of the key factors in the actin dynamics at an endocytic vesicle. Furthermore, recent studies have shown that some trans-acting proteins of the endocytic machinery are also mono-ubiquitinated, such as Rvs167p. In this PhD thesis it was found that Sjl2p and Sjl3p are modified by tyrosine phosphorylation as well as by ubiquitination, while Sjl1p was not. It is tempting to speculate that these modifications regulate the phosphatase activities of Sjl2p and Sjl3p.

Phosphorylierte Derivate von Phosphatidylinositol, auch als Phosphoinositide bezeichnet (PIs), sind zu einem geringen Anteil in der Zelle vertreten. Sie regeln verschiedene zelluläre Prozesse, wie beispielsweise Signalprozesse, das Wachstum und die Organisation des Aktinzytoskelettes. Die verschiedenen PI-Isoformen sind innerhalb der Zelle unterschiedlich verteilt. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat [PtdIns(4,5)P2] befindet sich zum Beispiel vorwiegend an der Plasmamembran und PtdIns(4)P an Membranen des Golgi-Apparates. Sie übernehmen auch regulatorische Aufgaben in Prozessen, die den Vesikeltransport vermitteln. Um eine korrekte Vesikelformation zu gewährleisten, muss die exakte Verteilung der PIs zum einen durch spezifischen PI Kinasen kontrolliert werden, welche an den entsprechenden Organellen lokalisieren. Zum anderen regulieren Phosphatasen und Lipasen die Dephosphorylierung und den Abbau von PIs. Frühere Studien beschrieben, dass die Dephosphorylation von PtdIns(4,5)P2 durch die Polyphosphoinositid-Phosphatase Synaptojanin 1 vermutlich ein wichtiger Schritt in der Clathrin/Aktin-vermittelten Endozytose in Säugetierzellen ist. Seither bekräftigen Hinweise aus verschiedenen Modellorganismen die Annahme, dass die Synaptojanin-Proteine bei der Abdissoziation von Komponenten der Clathrin-umhüllten Transportvesikel eine Rolle spielen. Mitglieder der hochkonservierten Familie der Synaptojanin Proteine bestehen aus drei Domänen. Die N-terminale Domäne hydrolysiert in einigen Familienmitgliedern PI-Isoformen an der 3', 4' und 5' Position des Inositolrings (PPIP-Aktivität). Die zentrale Domäne, die PI 5'Phosphatase (5-Pase), hydrolysiert spezifisch die Phosphatgruppe an der Position 5' des Inositolringes von PtdIns(4,5)P2. Die C-terminal gelegene, prolinreiche Domäne (PRD) ist variabel innerhalb der verschiedenen Familienmitglieder. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert drei Synaptojanin-ähnliche (Sjl) Proteine, Sjl1p, Sjl2p und Sjl3p (oder Inp51p, Inp52p und Inp53p). Alle drei Familienmitglieder besitzen 5-Pase- Aktivität, die katalytische PPIP- Aktivität besitzen jedoch nur Sjl2p und Sjl3p. Während Sjl1p bisher nicht dem Vesikeltransport zugeordnet werden konnte, existierten bereits Hinweise dafür, dass Sjl3p am Clathrin-vermittelten Membranentransport zwischen dem trans-Golgi Netwerk (TGN) und Endosomen beteiligt ist. Diese Doktorarbeit fokussiert sich auf die vermutete Rolle der Sjl2p-Phosphatase in der Clathrin/Aktin-vermittelten Endozytose. Zu Beginn dieser Arbeit wurden Beweise erbracht, dass jedes Hefe-Synaptojanin Familienmitglied mit in vitro polymerisierten Aktinfilamenten assoziiert. Jedoch scheint Sjl1p fester an Aktinfilamente zu binden als Sjl2p und Sjl3p. Um Bindungspartner von Sjl2p zu identifizieren, wurden GST-Pulldown Experimente und Co-Immunopräzipitationen durchgeführt. In GST-Pulldown Versuchen mit der prolinreichen Domäne von Sjl2p konnte Rvs167p als Bindungspartner identifiziert werden, das wahrscheinlich an der Abschnürung endozytotischer Transportvesikel beteiligt ist. Außerdem wurde End3p nachgewiesen, welches sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt am Ort der Endozytose befindet. Ein wichtiger Beweis für eine Beteiligung von Sjl2p an Clathrin-vermittelten Transportprozessen war der Nachweis der Hüllkomponente Clathrin (Chc1p). Die Co-Immunopräzipitationen identifizierten Sjl2p scheint außerdem mit Sla1p und Pan1p einen Komplex zu bilden, der jedoch vermutlich nur transient existiert. In S. cerevisiae war die Frage noch offen, ob die Sjl-Proteine mit Clathrin-umhüllten Vesikeln (CCV) assoziieren. Mittels Sephacryl S-1000 Gelfiltrations-Chromatographie konnte gezeigt werden, dass Sjl2p und Sjl3p mit CCVs co-fraktionierten, wohingegen Sjl1p zusammen mit den Peaks der zytosolischen Phosphoglyceratkinase und Aktin co-eluierte, welche klar von den CCV-Fraktionen getrennt waren. Somit weisen die Ergebnisse der Co-Immunopräzipitationen und der GST-Pulldowns dieser Doktorarbeit, dass Sjl2p an endozytotischen CCVs zu finden ist. Sjl3p assoziiert vermutlich mit CCVs, die am TGN gebildet werden. Immer mehr Daten sprechen dafür, dass posttranslationale Modifikationen eine Schlüsselrolle in vielen, wenn nicht sogar allen, zellulären Prozessen in Eukaryonten einnehmen. In S. cerevisiae spielt die Modifikation von Proteinen der Endozytosemaschine, sogenannter trans-agierender Proteine, mittels Phosphorylierung zum Beispiel eine Rolle bei der Aktindynamik am endozytotischen Vesikel. Neueste Ergebnisse zeigen, dass trans-agierende Proteine auch mono-ubiquitiniert werden können, wie zum Beispiel Rvs167p. Während dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, dass Sjl2p und Sjl3p, aber nicht Sjl1p, sowohl durch Tyrosin-phosphorylierung als auch Ubiquitinierung posttranslational modifiziert werden. Möglicherweise werden die PI Phosphatase-Aktivitäten von Sjl2p und Sjl3p dadurch reguliert.