Asparaginsäure-vermittelte enzymatische Reaktionen

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Promiskuität zweier Enzyme aus unterschiedlichen Proteinklassen, die allerdings auf eine gemeinsame, in der Biochemie sehr häufige Reaktion, die Säure-(Base)-Reaktion, zurückgreifen. Beide Enzyme verwenden die Asparaginsäure als katalytisch aktive Aminosäure, wobei Haloalkan Dehalogenasen aus der alpha/beta-Hydrolase-Familie, die deprotonierte Form der Asparaginsäure als nukleophiles Aspartat verwenden, wohingegen die Squalen-Hopen-Zyklasen die protonierte Asparaginsäure als Brønsted-Säure nutzen. Das Substratspektrum der Dehalogenase LinB aus Sphingobium japonicum, das sonst nur halogenierte Alkane umfasst, sollte um alternative Substrate erweitert werden. Es konnte erfolgreich demonstriert werden, dass LinB eine eindeutige Hydrolyseaktivität gegenüber organischen Thiocyanaten und Isothiocyanaten aufweist, was auf erstmals beschriebene promiskuitive Eigenschaften der LinB schließen lässt. Es konnte gezeigt werden, dass Substrate von unterschiedlicher Größe toleriert werden, um dabei Alkohole und Amine zu generieren. Mittels rationalem Design konnten Varianten erzeugt werden, die eine deutliche Verbesserung gegenüber der Bildung von Benzylamin demonstrierten. Zur Untersuchung der Art der Promiskuität, wurden sogenannte knockout-Mutanten der katalytischen Triade der LinB erstellt und für Studien bezüglich des Katalysemechanismus herangezogen. In der Tat konnte über die einfache Substratpromiskuität hinaus, katalytische Promiskuität der LinB in Bezug auf die organischen Isothiocyanate gezeigt werden. Anhand der Squalen-Hopen-Zyklase aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurden Untersuchungen bezüglich intermolekular katalysierter Reaktionen vorgenommen. Diese Fähigkeit der Etherbildung ist zwar bei der nativen AacSHC anhand des Substrates Farnesol bekannt, allerdings nur in geringem Umfang. So konnte mittels Varianten aus einer fokussierten Mutantenbibliothek eine 10-fache Steigerung der Produktbildung erzielt werden. Ferner konnten unter Verwendung nicht-natürlicher Substrate und unterschiedlicher Nukleophile neue, nicht-literaturbekannte intermolekular gebildete Produkte dargestellt werden. Durch die Wahl des Nukleophils und dessen Konzentration gelang es, Produktverhältnisse eindeutig zu Gunsten der intermolekular gebildeten Produkte zu verschieben.

The present study deals with the investigation of the promiscuity of two enzymes from different proteinfamilies, which however draw on a common reaction, the acid (-base)-reaction. Both enzymes use an aspartic acid as catalytically active amino acid: haloalkane dehalogenases from the alpha/beta-hydrolase fold family use the deprotonated form for nucleophilic attack, whereas the squalene-hopene-cyclases use the protonated form as Brønsted-acid. The substrate scope of the dehalogenase LinB from Sphingobium japonicum, which includes only halogenated alkanes so far, should be expanded towards alternative substrates. In this work, it was successfully demonstrated, that LinB exhibits unambiguously hydrolysis-activity towards organic thiocyanates and isothiocyanates, which indicates the promiscuous character of LinB for the first time. Different sizes of substrates where tolerated for generating alcohols and amines. Through rational design, variants could be generated, which showed a significant improvement in formation of benzylamine. To study the type of promiscuity, so-called knockout mutants were created for studies concerning the reaction mechanism. In fact, LinB demonstrated not only substrate promiscuity but additional catalytic promiscuity. With the squalene-hopene-cyclase from Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC), studies concerning intermolecular catalyzed reactions were performed. AacSHC is known to form ethers through intermolecular linkage, when farnesol is used as substrate, but only to a limited extent. In the present study, a 10-fold increase in product formation with variants of a focused AacSHC mutant library was achieved. Using non-natural substrates and an extended set of nucleophiles, new intermolecular formed products could be generated. Furthermore, it was possible to shift the product distribution clearly in favor of intermolecular formed products only with the choice of the nucleophile and its concentration.