Funktionsverlust der Ionenpumpe Pmr1 induziert programmierten Zelltod in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In der Hefezelle Saccharomyces cerevisiae werden die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen durch Ca2+-Kanäle und ATPasen reguliert. Pmr1, die Ca2+-ATPase des Golgi-Apparates, bildet einen Eckpfeiler der Ca2+-Homöostase. So erfolgt nach einem raschen Anstieg der freien zytosolischen Ca2+-Konzentration, z.B. durch das Öffnen von Mid1/Cch1 Ca2+- Kanälen in der Plasmamembran ein aktives Entfernen von Ca2+ aus dem Zytosol. Pmr1 transportiert sowohl Ca2+ als auch Mn2+ aus dem Zytosol in den Golgi-Apparat. Künstlich erzeugte Funktionsstörungen dieser Transporter haben für eine Zelle weitreichende Konsequenzen. Eine pmr1-Mutation ist nicht letal, aber sie verursacht einen schnellen Verlust der Lebensfähigkeit in stationärer Phase. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Zellen typische Merkmale der Apoptose aufweisen. Der Apoptoseprozess ist morphologisch durch die Aufhebung der asymmetrischen Verteilung der Phospholipide der Plasmamembran, die Kondensation des Chromatins an der Kernhülle und die Zellfragmentierung in so genannte apoptotische Körper gekennzeichnet. Da Pmr1 für die korrekte Physiologie des Golgi-Apparates benötigt wird und somit eine zentrale Komponente der Sekretionsmaschine ist, wurde bei weiteren Sekretionsmutanten nach apoptosetypischen Merkmalen gesucht. Die meisten sec-Mutationen sind letal. Bei konditionellen ts sec-Mutanten konnte unter restriktiver Temperatur Chromatinkondensation durch Anfärben mit Diaminophenylindol, einem selektiven, blau fluoreszierenden und in DNA interkalierenden Farbstoff, gezeigt werden. Um die Degradation der DNA nachzuweisen wurde der TUNEL Test (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) angewandt. Der Zustand der Plasmamembran wurde mit Annexin V aufgezeigt. In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass eine Mutation in dem Ca2+-Transporter des Golgi-Apparates Pmr1 zu drastischen Veränderungen in der Zellwand führen. Eine starke Reduktion der totalen Zellwandmasse und eine Verschiebung der zuckerhaltigen Zellwandkomponenten Glukose, Mannose und N-Acetylglucosamin liegen vor. In pmr1-Mutanten ist auch die Konzentration der katalytischen Untereinheit der β-1,3 Glukansynthase, einem Schlüsselenzym der Zellwandsynthese, stark erhöht. Diese Änderung des pmr1-Expressionsmusters wurde mit Hilfe eines Fks2/LacZ-Reporters detektiert. Weiterführend wurde eine genetische Methode entwickelt, um in Verbindung mit pmr1 synthetisch letale Mutationskombinationen zu identifizieren. Als genetische Interaktionspartner von Pmr1 wurden dadurch die proteinglycosylierende Golgi-Apyrase Ynd1 und eine Komponente des Mannosylpolymerase1 Komplexes Van1 gefunden.

The yeast Saccharomyces cerevisiae controls the intracellular Ca2+-concentrations via Ca2+-cannels and ATPases. Pmr1 is the Ca2+-ATPase mainly localized in the golgi constituting one player of the Ca2+-homeostasis. After a rapid increase in the cytosolic Ca2+-concentration through the Mid1/Cch1 PM channel follows the active removal of Ca2+-ions from the cytosol. Beside Ca2+-Ions Pmr1 transports also Mn2+-Ions from the cytosol into the golgi lumen. Artificial loss of functions of these transporters result in a wide spread of consequences. A pmr1-mutation is not lethal but induces a rapid viability loss of stationary cells. It is shown in this work, that those dying cells show typical markers of apoptotic cell death like phosphatidylserine externalisation, chromatin condensation and fragmentation into so called apoptotic bodies. Pmr1 is essential for the correct morphology of the golgi, the central organell of the secretory pathway. We therefore looked for the apoptotic markers in conditional secretion mutants. We found chromatin condensation (DAPI) and fragmentation of the DNA (TUNEL-test) in sec-mutants under restricive conditions. The altered state of the PM was shown by Annexin V staining. In this context we recognized that the pmr1-mutation leads to dramatic changes in the cell wall. A strong reduction of the total cell wall content and an adjustment of the carbohydrate contents glucose, mannose and glucosamine are present in pmr1-mutants. Also the expression level of Fks2 (catalytic subunit of β-1.3 glukan synthase), the key enzyme of the cell wall integrity pathway, is strongly increased in pmr1-mutants. Continuative a genetic method was developed to recognize synthetic lethal mutations in combination with pmr1-mutations. This work identified 5 interaction partners genetic with Pmr1. The golgi apyrase Ynd1, an component of the mannosyl transferase complex Van1 beside Bst1, Sac2 and Vps24.