CYP102A P450 monooxygenases: comparative analysis and construction of cytochrome P450 chimera

Abstract

The members of the CYP102A subfamily are in several ways unique. They are natural fusion proteins of approximately 117-119 kDa comprised of the N terminal monooxygenase domain and a FAD and FMN containing diflavin reductase domain. These fatty acid hydroxylases exhibit extraordinary activities of 3000-10000 min-1 in comparison to other P450 monooxygenases making them promising candidates for industrial applications. Up to now, cloning and characterisation of only three members of this subfamily have been published: CYP102A1 from Bacillus megaterium and CYP102A2 and CYP102A3 from Bacillus subtilis strain 168. We have currently cloned and characterised another member of this family, CYP102A7, and there are at least eight more genes for CYP102A monooxygenases, which have been identified in several genome sequencing projects. Multiple sequence alignment of all amino acid sequences revealed that the similarity between different members is between 50 and 90 % according to which these enzymes can be divided into four groups. The four cloned enzymes belonging to three different groups but with 65 to 70 % similarity were used for further investigation. Despite their appearance to be similar, they often exhibit different properties. For example, the new isolated CYP102A7 catalyses the deethylation of 7-ethoxycoumarin which is not accepted as substrate by CYP102A1, CYP102A2 and CYP102A3. The hydroxylation patterns produced by these four monooxygenases are also different. Additionally we investigated solvent and thermal stability of these P450 monooxygenases. For example, the monooxygenase domain of CYP102A1 is much more stable than those of CYP102A2and CYP102A3. On the other hand, its reductase domain is less stable than the corresponding ones of CYP102A2 and CYP102A3. Therefore we exchanged the natural more unstable reductase domain of CYP102A1 with the more stable reductase domain of CYP102A3, using the natural linker of CYP102A1. The new chimera was able to hydroxylate substrates within a wider temperature range (up to 50°C) compared to the parental enzymes, showed higher process stability and has a half-life at 50°C more than ten times longer than CYP102A1. Further we substituted the reductase domain of CYP102A1 by a thermostable analogue. In the genome of the thermophilic Geobacillus stearothermophilus a gene was found exhibiting 50 % protein similarity to the reductase domain of CYP102A1. The gene encodes a hypothetical alpha-subunit of a sulfite reductase, but also belongs to the diflavin reductases. This reductase was cloned downstream of the monooxygenase domain of CYP102A1. Activity of the foreign reductase within the chimera A1GR was confirmed by cytochrome c reduction. Next to the ability to transfer electrons to the heme iron, oxidation of C14-C18 fatty acids was proven. While the hydroxylation activity of CYP102A1 towards myristic and palmitic acid decreased to about 5 % of the initial rate after incubation at 49°C, the chimera exhibited no loss of activity under the same conditions.

Die CYP102A Unterfamilie stellt aufgrund ihrer strukturellen Organisation eine Besonderheit dar. Ihre Mitglieder sind natürliche Fusionsproteine aus einer N-terminalen Häm-Monooxygenase Domäne und einer C-terminalen FAD und FMN enthaltenen Diflavinreduktase. Aufgrund ihrerer ungewöhnlich hohen Aktivitäten (3000-10000 min-1) im Vergleich zu andereren P450 Monooxygenasen stellen sie interessante Kandidaten für industrielle Anwendungen dar. Bisher wurden die Klonierung und Charakterisierung von drei Mitgliedern dieser Unterfamilie publiziert: CYP102A1 aus Bacillus megaterium sowie CYP102A2 und CYP102A3 aus Bacillus subtilis. Kürzlich gelang uns die Klonierung und Charakterisierung eines weiteren Mitglieds, CYP102A7 aus Bacillus licheniformis, jedoch wurden noch mindestens acht weitere Gene durch Genom Sequenzierungen identifiziert. Durch Vergleich aller Aminosäuresequenzen konnte eine Ähnlichkeit zwischen den einzelnen Mitgliedern von 50-90 % festgestellt werden anhand derer sich die Enzyme in 4 Gruppen einteilen lassen. Die vier klonierten Enzyme welche zu drei verschiedenen Gruppen mit 65-70 % Ähnlichkeit gehören wurden für weitere Untersuchungen verwendet. Obwohl sie sehr ähnlich erscheinen zeigen sie doch unterschiedlich Eigenschaften. CYP102A7 ist zum Beispiel in der Lage 7-Ethoxycumarin zu deethylieren, welches weder von CYP102A1 noch CYP102A2 oder CYP102A3 als Substrat akzeptiert wird. Die Hydroxylierungsmuster die von diesen vier Monooxygenasen bei der Oxygenierung von Fettsäuern produziert werden sind ebenfalls unterschiedlich. Zusätzlich untersuchten wir die Lösungsmittel- und Thermostabilität dieser P450 Monooxygenasen. Es zeigte sich, daß die Monooxygenasedomäne aus CYP102A1 viel stabiler war als aus CYP102A2 oder CYP102A3, wohingegen die Reduktasedomäne in CYP102A1 eine geringere Stabilität als die entsprechenden Domänen in CYP102A2 und CYP102A3 aufwiesen. Aus diesem Grund tauschten wir die instabilere Reduktasedomäne aus CYP102A1 gegen die stabilere Domäne aus CYP102A3 unter Beibehaltung der natürlichen Linkerregion aus CYP102A1 aus. Die neue Chimäre konnte Substrate in einem größeren Temperaturbereich (bis 50°C) als die Parental Enzyme hydroxylieren, zeigte eine höhere Prozessstabilität und wies eine um zehnfach längere Halbwertszeit als CYP102A1 bei 50°C auf. Zusätzlich ersetzten wir die Reduktasedomäne von CYP102A1 durch ein thermostabiles Analogon. Durch Sequenzierung des thermophilen Stammes Geobacillus stearothermophilus konnte ein Gen, mit 50 % Ähnlichkeit zur Reduktasedomäne von CYP102A1 identifiziert werden. Dieses Gen codiert für eine hypothetische alpha Untereinheit einer Sulfitreduktase gehört jedoch auch zu den Diflavinreduktasen. Die Aktivität der fremden Reduktase in der Chimäre A1GR konnte durch Reduktion von Cytochrom C gezeigt werden. Neben der Fähigkeit Elektronen an das Häm-Eisen zu liefern konnte auch die Hydroxylierungsaktivität gegenüber C14-C18 Fettsäuren nachgewiesen werden. Während CYP102A1 nur noch 5% seiner Anfangsaktivität gegenüber Myristin-und Palmitinsäure nach Inkubation bei 49°C aufwies, zeigte die Chimäre keinen Aktivitätsverlust unter den gleichen Bedingungen.