Novel route to vanillin - an enzyme-catalyzed multi-step cascade synthesis

Abstract

The selective hydroxylation of aromatic compounds is one of the most challenging chemical reactions. As an alternative to traditional chemical catalysis, biocatalysis emerged during the past decades. Hence, in the present work, a number of biocatalysts was investigated with regard to the realization of a novel synthesis route to the valuable aromatic compound vanillin, starting from the simple low-cost aromatic substrate 3-methylanisole via the intermediate products 3-methoxybenzyl alcohol or 4-methylguaiacol and via vanillyl alcohol, as an example of consecutive enzyme-catalyzed oxidation reactions accomplished in a multi-enzymatic three-step cascade reaction. For this reason a preselected set of enzymes, namely the m-hydroxybenzoate hydroxylase MobA from Comamonas testosteroni GZ39 and the cytochrome P450 monooxygenases CYP116B3 from Rhodococcus ruber DSM 44319 and CYP102A1 from Bacillus megaterium ATCC 14581, was investigated towards the selective hydroxylation of the substrate 3-methylanisole. Beside the wild type enzymes, a variant of MobA, which was created by rational protein design, and an existing focused minimal mutant library of CYP102A1 were applied in initial biotransformation reactions, combined with an efficient cofactor recycling system. Though the wild type enzymes of CYP116B3 and CYP102A1 displayed only a basic level of activity towards 3-methylanisole, highly increased activity was detected for many of the CYP102A1 variants with a maximum of 59% total conversion for the double mutant F87V/A328L. With 3-methoxybenzyl alcohol and 4-methylguaiacol both intermediate compounds of the intended cascade synthesis were generated, though 4-methoxy-2-methylphenol was the main product in most of the reactions. However, none of the so far investigated variants accepted any of the intermediate compounds as substrate. As CYP116B3 was a good candidate for further protein engineering approaches, as a basic level of activity towards the substrate of interest was already present in the wild type enzyme, a focused mutant library of 20 single mutant variants of CYP116B3 was created based on literature, sequence and structure information in order to improve the enzymes activity and selectivity towards conversion of the substrate 3-methylanisole and in order to find variants for the conversion of 3-methoxybenzyl alcohol and/or 4-methylguaiacol. Therefore a homology model of the monooxygenase domain of CYP116B3 was generated. Though, compared to the wild type, variants with up to almost six time increased activity towards the model substrate 7-ethoxycoumarin were found, total activity towards 3-methylanisole was still much lower compared to the best CYP102A1 variants. In addition, none of the variants displayed appropriate conversion of the intermediate compounds 3-methoxybenzyl alcohol and 4-methylguaiacol. Moreover, additional mutation in the literature known amino acid position 437 of CYP102A1 variant F87V/A328L revealed no benefit towards conversion of any of the substrates, too. Molecular dynamics simulations of a CYP102A1 variant with 4-methylguaiacol as substrate revealed the bottleneck in the conversion of this compound. 4-Methylguaiacol was shown to be stabilized at the entrance of the substrate access channel by the polar amino acid residues R47 and Y51. Replacement of these residues by the hydrophobic residues leucine and phenylalanine, respectively, resulted in successful conversion of 4-methylguaiacol to vanillyl alcohol, the precursor of vanillin in the intended cascade synthesis. Though, as the yield of vanillyl alcohol synthesized from 4-methylguaiacol with CYP102A1 variants was rather low, a vanillyl alcohol oxidase from Penicillium simplicissimum and rationally designed variants thereof, described in literature, were investigated. As a result, not only vanillyl alcohol but also 4-methylguaiacol was converted in high yield to vanillin. Finally, a combination of the best 4-methylguaiacol producing variant, CYP102A1 variant A328L, with the best 4-methylguaiacol converting variant, VAO variant F454Y, in one reaction system both in vitro and in vivo yielded vanillin from 3-methylanisole with a maximal product formation of 2.0% and 1.1% vanillin, respectively. We demonstrated as a proof-of-principle the establishment of the proposed multi-enzymatic three-step cascade reaction pathway. Though further optimizations concerning increase of enzyme activity and improvement of enzyme selectivity are required, the above mentioned exemplary synthesis of vanillin illustrates the capability of biocatalysis.

Die selektive Hydroxylierung aromatischer Verbindungen ist eine der herausforderndsten chemischen Reaktionen. Als eine Alternative zur traditionellen chemischen Katalyse hat sich die Biokatalyse während der vergangenen Jahrzehnte entwickelt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Biokatalysatoren hinsichtlich der Verwirklichung einer neuen Syntheseroute zu der wertvollen aromatischen Verbindung Vanillin untersucht. Dies sollte, ausgehend von dem einfachen und preiswerten Substrat 3-Methylanisol, über die Zwischenprodukte 3-Methoxybenyzlalkohol oder 4-Methylguaiacol und über Vanillylalkohol, als Beispiel für aufeinanderfolgende enzymkatalysierte Oxidationsreaktionen in einer multienzymatischen dreistufigen Kaskadenreaktion bewerkstelligt werden. Aus diesem Grund wurde eine Auswahl an Enzymen, und zwar die m-Hydroxybenzoathydroxylase MobA aus Comamonas testosteroni GZ39 und die Cytochrom P450 Monooxygenasen CYP116B3 aus Rhodococcus ruber DSM 44319 und CYP102A1 aus Bacillus megaterium ATCC 14581, hinsichtlich der selektiven Hydroxylierung des Substrates 3-Methylanisol untersucht. Neben den Wildtyp-Enzymen wurde eine Variante von MobA, die durch rationales Proteindesign erstellt wurde, und eine bestehende fokusierte Minimalmutantenbibliothek von CYP102A1 kombiniert mit einem effizienten Cofaktor-Regenerierungssystem in anfänglichen Biotransformationsreaktionen angewendet. Obwohl die Wildtyp-Enzyme von CYP116B3 und CYP102A1 nur eine geringe Grundaktivität gegenüber 3-Methylanisol zeigten, wurde für viele der CYP102A1-Varianten eine sehr viel höhere Aktivität gemessen, mit einem Maximum von 59% Gesamtumsetzung für die Doppelmutante F87V/A328L. Mit 3-Methoxybenzylalkohol und 4-Methylguaiacol wurden beide Zwischenprodukte der angestrebten Kaskadensynthese hergestellt. Allerdings war 4-Methoxy-2-methylphenol das Hauptprodukt in den meisten der Reaktionen. Indes akzeptierte keine der bis hierhin untersuchten Varianten irgendeines der Zwischenprodukte als Substrat. Da CYP116B3, aufgrund seiner bereits im Wildtyp-Enzym vorhandenen grundsätzlichen Aktivität gegenüber dem Substrat, ein guter Kandidat für weitere Protein Engineering Ansätze war, wurde basierend auf Literatur-, Sequenz- und Strukturinformationen eine fokusierte Mutantenbibliothek von CYP116B3 erstellt. Dies geschah mit der Absicht die Enzymaktivität und -selektivität hinsichtlich der Umsetzung des Substrates 3-Methylanisol zu verbessern, und mit dem Ziel Varianten für die Umsetzung von 3-Methoxybenzylalkohol und/oder 4-Methylguaiacol zu finden. Deshalb wurde ein Homologiemodell der Monooxygenase-Domäne von CYP116B3 erstellt. Obwohl Varianten gefunden wurden, die im Vergleich zum Wildtyp eine bis nahezu sechsfach höhere Aktivität gegenüber dem Modellsubstrat 7-Ethoxycumarin gezeigt haben, war die Gesamtaktivität gegenüber 3-Methylanisol immer noch viel niedriger verglichen mit der besten CYP102A1-Variante. Außerdem zeigte keine der Varianten eine angemessene Umsetzung der Zwischenprodukte 3-Methoxy-benzylalkohol und 4-Methylguaiacol. Auch zusätzliche Mutationen an der literaturbekannten Aminosäureposition 437 der CYP102A1-Variante F87V/A328L zeigten keinen Nutzen hinsichtlich der Umsetzung eines der Substrate. Molekulardynamiksimulationen einer CYP102A1-Variante mit 4-Methylguaiacol als Substrat enthüllten den Engpass bei der Umsetzung dieser Verbindung. Es wurde gezeigt, dass 4-Methylguaiacol am Eingang des Substratzugangskanals durch die polaren Aminosäurereste R47 und Y51 stabilisiert wurde. Ein entsprechender Austausch dieser Aminosäuren durch die hydrophoben Aminosäuren Leucin und Phenylalanin hatte die erfolgreiche Umsetzung von 4-Methylguaiacol zu Vanillylalkohol zur Folge, welches die Vorstufe von Vanillin in der geplanten Kaskadensynthese war. Da die Ausbeute an Vanillylalkohol, welcher durch CYP102A1-Varianten aus 4-Methylguaiacol erhalten wurde, eher gering war, wurde eine Vanillylalkoholoxidase aus Penicillium simplicissimum untersucht, ebenso wie Varianten davon, die durch rationales Proteindesign hergestellt wurden und in der Literatur beschrieben sind. Als Ergebnis wurde nicht nur Vanillylalkohol, sondern auch 4-Methylguaiacol in hohem Maße zu Vanillin umgesetzt. Schließlich hat eine Kombination der besten 4-Methylguaiacol produzierenden Variante, CYP102A1-Variante A328L, zusammen mit der besten 4-Methylguaiacol umsetzenden Variante, VAO-Variante F454Y, in einem Reaktionssystem sowohl in vitro als auch in vivo Vanillin aus 3-Methylanisol erzeugt, mit einer entsprechenden maximalen Produktbildung von 2,0% beziehungsweise 1,1% Vanillin. Somit konnte die angestrebte multienzymatische dreistufige Kaskadenreaktion als grundsätzliches Konzept erfolgreich etabliert werden. Trotz dessen, dass weitere Optimierungen hinsichtlich der Erhöhung der Enzymaktivität und der Verbesserung der Enzymselektivität erforderlich sind, verdeutlicht die oben erwähnte exemplarische Synthese von Vanillin das Leistungsvermögen der Biokatalyse.