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Autor(en): Richter, Fabian
Titel: Evolution of the antagonistic tumor necrosis factor receptor one-specific antibody ATROSAB
Sonstige Titel: Die Evolution des antagonistischen Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Eins-spezifischen Antikörpers ATROSAB
Erscheinungsdatum: 2015
Dokumentart: Dissertation
Seiten: 161
URI: http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/9213
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-92132
http://dx.doi.org/10.18419/opus-9196
Zusammenfassung: The pleiotropic cytokine tumor necrosis factor (TNF) is involved in numerous processes of human physiology and its dysregulated expression affects multiple, mainly inflammatory or autoimmune diseases. Thus, TNF-neutralizing therapeutics are highly successful in the treatment of e.g. rheumatoid arthritis or Crohn's disease. However, the resulting blockade of both TNF receptors (TNFR1 and TNFR2) led to diverse, sometimes serious side effects. Recently, the detrimental effects of chronic TNF activity were attributed to TNFR1 and hence, its selective blockade represents a promising therapeutic strategy. This thesis presents further data on the in vitro characterization of the antagonistic TNFR1-specific antibody ATROSAB and the development of a novel promising therapeutic candidate for selective TNFR1 inhibition. ATROSAB revealed greatly reduced or lacking induction of Fc-mediated effector functions, due to mutations introduced into the Fc part. According to a previous study, these mutations did not affect the pharmacokinetic profile of ATROSAB in wild type mice. However, reduced terminal serum half-life in transgenic mice, expressing the extracellular domain of human TNFR1, suggested a target-mediated clearance from the circulation. Moreover, ATROSAB bound with a high bivalent (0.2 nM) and a moderate monovalent affinity (73 nM) to TNFR1, resulting in inhibition of TNFR1 binding and activation by TNF with IC50 values in the nanomolar range. ATROSAB also inhibited phosphorylation of Iκ-Bα, indicating suppression of TNFR1-mediated intracellular signal transduction. The marginal TNFR1 simulation observed for ATROSAB was compared with the highly agonistic murine antibody Htr-9, supporting the overall antagonistic character of ATROSAB. However, in the presence of an anti-IgG1 antibody, ATROSAB clearly induced interleukin release from HT1080 cells. Moreover, a mutagenesis study showed that the epitope of ATROSAB on TNFR1 comprises residues P23, R68 and H69 of the receptor. In the following, the effect of the molecular format on TNFR1 binding and activation was assessed by the production and characterization of alternative mono- or bivalent antibody formats. Exclusively ATROSAB revealed hardly any stimulatory effect and thereby substantiated its unique antagonistic potential, when compared with the remaining bivalent molecules, clearly activating TNFR1. Furthermore, the decreased inhibitory potential of ATROSAB, compared with its parental mouse antibody H398, could be attributed to an increased dissociation rate constant. Using the scFv format, affinity/off-rate maturation was subsequently performed by phage display. In addition, exchange of the light chain framework regions by alternative germline sequences (scFvFRK13.7) resulted in better TNFR1 binding and higher thermal stability. The corresponding Fab13.7 exhibited improved monovalent TNFR1 binding and, compared with ATROSAB, superior inhibition of TNF-mediated TNFR1 activation. Moreover, Fab13.7 did not reveal any detectable activating effect on TNFR1, even in the presence of anti-Fab serum antibodies, while the related IgG13.7 induced a strong TNFR1 response. Finally, the gained insights into TNFR1 biology were implemented into a mechanistic model of TNFR1 activation, suggesting a change in the conformation or orientation of interacting TNFR1 molecules between inactive and active state, which is in contradiction to former hypotheses postulating TNFR1-activation by ligand-induced receptor trimerization.
Das pleiotrope Zytokin Tumor Nekrose Faktor (TNF) ist an vielzähligen biologischen Prozessen beteiligt und seine deregulierte Expression beeinflusst etliche, zumeist autoimmune oder entzündliche Erkrankungen. Folglich konnten TNF neutralisierende Therapeutika mit großem Erfolg gegen Krankheiten wie beispielsweise Rheumatoide Arthritis oder Morbus Crohn eingesetzt werden, wobei die damit einhergehende Blockade beider TNF Rezeptoren (TNFR1 und TNFR2) zu schwerwiegenden Nebenwirkungen geführt hat. Insbesondere TNFR1 wurde kürzlich den schädigenden TNF-Wirkungen zugeordnet, weshalb seine selektive Blockade eine vielversprechende therapeutische Strategie darstellt. In dieser Studie werden weitergehende Daten der in vitro Charakterisierung des antagonistischen TNFR1-spezifischen Antikörpers ATROSAB und die Entwicklung eines vielversprechenden Moleküls für die selektive therapeutische Inhibierung von TNFR1 präsentiert. ATROSAB zeigte aufgrund der eingefügten Mutationen keine oder nur minimale Fc-vermittelten Effektorfunktionen. In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass diese Mutationen keinen Einfluss auf die Serum-Halbwertszeit von ATROSAB im Blut von Wildtyp-Mäusen haben. Das pharmakokinetische Profil von ATROSAB in transgenen Mäusen, welche die extrazelluläre Domäne des human TNFR1 exprimieren, legt jedoch eine Rezeptor-bedingte Beseitigung aus dem Blutkreislauf nahe. ATROSAB interagierte mit TNFR1 über eine hochaffine, bivalente Bindung (0,2 nM) und eine monovalente Bindung mit moderater Affinität (73 nM). Dies führte in Interleukin-Freisetzung Experimenten zu IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Eine Hemmung der TNFR1-vermittelten intrazellulären Signaltransduktion durch ATORSAB konnte anhand der inhibierten Phosphorylierung von Iκ Bα gezeigt werden. Die zuvor für ATROSAB beobachtete marginale TNFR1-Aktivierung wurde mit dem stark antagonistischen, murinen Antikörper Htr-9 verglichen, wodurch der antagonistische Charakter von ATROSAB bestätigt werden konnte. Im Gegensatz dazu zeigte ATROSAB in Gegenwart eines anti-IgG1 Antikörpers eine klare Aktivierung von TFNR1. Darüber hinaus wurden die Aminosäuren P23, R68 und H69 im TNFR1-Molekül als ATROSAB-Bindestelle identifiziert. Im Folgenden wurde die Auswirkung einer Veränderung des Molekülformats auf die TNFR1-Bindung und -Aktivierung anhand von alternativen Antikörperformaten und Antikörper-Fusionsproteinen mit einer bzw. zwei der TNFR1-Bindungsdomänen von ATROSAB untersucht. Im Vergleich mit den übrigen, stark Rezeptor-aktivierenden, bivalenten Molekülen zeigte ausschließlich ATROSAB keine nennenswerte stimulierende Wirkung, wodurch der einzigartige Antagonismus von ATROSAB ein weiteres Mal hervor gehoben werden konnte. Die verminderte TNFR1-hemmende Wirkung von ATROSAB, im Vergleich zu seinem murinen Vorgänger H398, konnte einer erhöhten Dissoziierungskonstante zugeordnet und diese Beobachtung anschließend in einer Affinitäts- bzw. Dissoziierungs-Reifung mittels Phage Display auf Basis des scFv-Formates angewendet werden. Der zusätzliche Austausch der Framework-Regionen der leichten Kette (scFvFRK13.7) resultierte zudem in einer erhöhten Thermostabilität. Das korrespondierende Fab13.7 zeigte eine verbesserte TNFR1-Bindung und im Vergleich mit dem bivalenten ATROSAB eine effizientere Hemmung der TNF-vermittelten TNFR1-Aktivierung. Darüber hinaus zeigte Fab13.7 keinerlei aktivierende Wirkung auf TNFR1, im Gegensatz zum entsprechenden, bivalenten IgG13.7, das eine starke TNFR1-Antwort hervorrief. Schlussendlich wurden die in den Experimenten gewonnenen Einsichten in die TNFR1-Biologie auf das Erstellen eines mechanistischen Modells der TNFR1 Aktivierung angewandt, welches eine veränderte relative Orientierung der beiden interagierenden Rezeptor-Moleküle bzw. eine Konformations-Änderung der Rezeptor-Struktur zwischen aktivem und inaktivem Zustand vorschlägt. Dies steht im Widerspruch zu vorherigen Hypothesen, welche der TNFR1-Aktivierung eine Liganden-Induzierte Trimerisierung des Rezeptors zugrunde legten.
Enthalten in den Sammlungen:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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