Regulation of protein turnover in fission yeast

Abstract

Proteins are molecular machines that perform the majority of cellular functions that characterize living organisms. Protein levels within cells are the result of a delicate balance between protein synthesis and protein degradation. Eukaryotic cells are able to shift this balance to one or the other side to regulate the steady state level of each protein within a cell. If a protein or a functional group of proteins is needed to fulfill a certain duty, cells have evolved a number of pathways to increase the levels of these proteins rapidly. On the other hand, if a protein or functional group of proteins is no longer required, eukaryotes are able to rapidly decrease the concentrations of these proteins. While historically much attention and research has been devoted to how proteins are synthesized, the reverse process, i.e. how and when proteins are degraded, is not understood as well. This thesis is structured into three parts, addressing regulation of protein turnover on a molecular as well as on a system-wide level. In part one, to gain deeper insight into how eukaryotes regulate targeted protein degradation, the molecular mechanisms of regulation of Cullin-RING ubiquitin ligases (CRLs) by the COP9 signalosome (CSN), the deubiquitylating enzyme Ubp12p, and the cullin-associated protein Can1p were investigated in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. In a survey of eight F-box proteins, which confer target specificity to CRLs, the study uncovered the existence of variant F-box proteins lacking a critical proline residue required for efficient regulation by the CSN. The results suggest that distinctive features of the F-box motif specify the assembly of F-box proteins into CRL complexes thus destining them for regulation by the CSN through a mechanism, which can principally function independently of Can1p and Ubp12p. In part two, a large-scale biochemical approach was used to investigate whether E2 ubiquitin conjugating enzymes contribute to substrate selection. Because of the lack of a reliable method for the identification of specific ubiquitylation substrates, a new biochemical method termed SPASS allowing the study of specific E2 substrates was developed. SPASS was used to identify on a global scale ubiquitylation substrates of the S. pombe E2s Ubc7p and Ubc8p. Examination of the previously known and also the novel substrates revealed a potential new mechanism by which E2s confer substrate specificity utilizing heterodimerisation. Lastly in part three, to gain a system-wide insight on the regulation of protein expression in S. pombe, mRNA as well as protein levels of 1500 open reading frames were explored. For this purpose, a new label-free mass spectrometry based method allowing relative quantification of protein levels was developed. The fission yeast protein data showed considerable correlations with mRNA levels and with the abundance of orthologous proteins in budding yeast. Functional pathway analysis indicated that the mRNA–protein correlation is strong for proteins involved in signalling and metabolic processes, but increasingly discordant for components of protein complexes, which clustered in groups with similar mRNA-protein ratios. Self-organizing map clustering of large-scale protein and mRNA data from fission and budding yeast revealed coordinate but not always concordant expression of components of functional pathways and protein complexes.

Proteine sind molekulare Maschinen die den Grossteil der zellulären Vorgänge ausführen und damit allen Organismen Leben ermöglicht. In Zellen steht die vorhandene Menge eines jeden Genprodukts im Gleichgewicht von Synthese und Abbau. Um die Menge eines jeden einzelnen zellulären Proteins zu kontrollieren, können Eukaryonten dieses Gleichgewicht in Richtung Synthese oder Abbau verschieben. Falls eine Zelle ein bestimmtes Protein, oder eine funktionelle Gruppe an Proteinen zu einem bestimmten Zeitpunkt benötigt, muss sie die Menge dieser Proteine rasch erhöhen können und hat dazu Synthesewege evolviert. Falls ein Protein oder eine funktionelle Gruppe an Proteinen nicht mehr benötigt wird, können Eukaryonten diese Proteine sehr schnell abbauen. Wohingegen Proteinsynthese und Proteinabbau bei der Regulation von Zellfunktionen eine gleich wichtige Rolle spielen, sind aus historischen Gründen sind die Synthesewege besser erforscht als die Abbauwege. Daher gliedert sich diese Arbeit in drei Teile, welche die Regulation des Proteinumsatzes auf molekularer sowie auf systemweiter Ebene untersuchen. Der erste Teil setzt sich mit der molekularen Regulation von Cullin-RING Ubiquitinligasen (CRLs) durch das COP9 Signalosom (CSN), das deubiquityliernde Enzym Ubp12p und dem cullin-assoziirten Protein Can1p auseinander. Experimente wurden dazu in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe durchgeführt. Die Studie von acht F-box Proteinen, welche für die Spezifität von Ubiquitinligasen verantwortlich sind, deckte die Existenz einer Variante des F-box Motivs auf. Diese F-Box Variante, welcher ein spezifisches Prolin fehlt, kann nicht von dem Signalosom reguliert werden. Die Ergebnisse deuten an, dass die unterschiedliche Zusammensetzung des F-Box Motivs den Einbau der F-Box Proteine in CRLs und damit die Regulation durch das Signalosom bestimmt. Es wird gezeigt, dass dieser Mechanismus prinzipiell ohne Ubp12p und Can1p abläuft. Im zweiten Teil, wurde ein umfangreicher biochemischer Assay neu entwickelt, welcher für die Erforschung der Rolle von E2 ubiquitinkonjugierenden Enzymen bei der Substratauswahl angewandt wurde. Der SPASS benannte Assay wurde für die globale Identifikation von S. Pombe Ubc7p und Ubc8p Substraten angewandt. Die Untersuchungen der Ergebnisse, welche bekannte und neue E2 Substrate enthielten, deckten eine potenzielle neue Funktionsweise von E2s bezüglich der Substratspezifität auf, welche Heterodimerisierung andeutet. Um eine systemweite Einsicht in die Regulation von Proteinlevels in S. pombe zu bekommen, wurden die Expressionslevel von 1500 Genprodukten auf mRNA- und Proteinebene untersucht. Dazu wurde eine neue, auf Massenspektrometrie beruhende Methode für die Quantifizierung von Proteinlevel entwickelt. Die Ergebnisse offenbarten eine starke Korrelation der Proteinlevel mit den jeweiligen mRNA mengen, sowie als auch mit den Expressionsleveln von orthologen Proteinen der Bäckerhefe S. cerevisiae. Eine funktionelle Pathwayanalyse ergab eine hohe Protein-mRNA Korrelation für Proteine der Kategorien Signalling und metabolische Prozesse, wohingegen eine abnehmende Koordination für Untereinheiten von Proteinkomplexen festgestellt wurden. Clusteranalyse von S. pombe und S. cerevisiae Gen- und Proteinexpression durch self-organizing Maps ergab, dass funktionelle Pathways und Proteinkomplexe koordiniert aber in den zwei Organismen nicht immer übereinstimmend exprimiert sind.