Protein degradation from the mammalian endoplasmic reticulum

Abstract

In eukaryotes, one third of all proteins enter the secretory pathway. They do so in the endoplasmic reticulum (ER), an organelle that provides an oxidative environment filled with enzymes and chaperones that aid in protein folding. In the ER, secretory and transmembrane proteins undergo a productive folding cycle, acquire N-linked glycans, and assemble into multisubunit complexes prior to their exit to the Golgi. The surveillance mechanism in the ER that monitors the folding status of a protein is called ER quality control. Quality control ensures that only properly folded and assembled proteins can exit the ER. Accumulation of irreversibly misfolded proteins presents a threat to proper ER homeostasis and function and therefore to cell survival. Proteins that fail quality control are considered misfolded and are selectively retrotranslocated or dislocated into the cytosol for degradation by the cytosolic proteasome, in a process also referred to as ER associated degradation. Two type I ER transmembrane proteins, US2 and US11, encoded by human cytomegalovirus (HCMV), co-opt the cellular dislocation pathway by catalyzing the dislocation of class I MHC (major histocompatibility complex) heavy chain (HC) molecules from the ER to avoid detection by the immune system. US2 and US11 both target the same molecules but do so by recruiting different sets of proteins. US2 uses signal peptide peptidase (SPP) to degrade class I MHC, whereas US11 seems to engage a more conserved pathway superficially similar to that used by yeast: The polytopic transmembrane protein Derlin-1, the homolog of yeast Der1p, is required for dislocation of HCs in US11, but not in US2 expressing cells. Derlin-1 can oligomerize with another member of the Derlin family, Derlin-2. Derlin-2 forms a complex with p97 and with orthologs of the Hrd1p/Hrd3p ligase complex. In this thesis I investigated the contribution of the human ortholog of Hrd3p, SEL1L, to heavy chain dislocation as catalyzed by US11. SEL1L is a type I transmembrane protein with a large globular domain containing multiple repeated regions of the tetratricopeptide repeat (TPR) family, suggesting that it might be involved in substrate recognition. Here I provide evidence that SEL1L is essential for HC dislocation in US11, but not in US2 cells. Furthermore I was able to show that SEL1L is required not only for the degradation of a truncated thereby misfolded version of ribophorin (RI332), but also binds only to misfolded RI332, and not to properly folded ribophorin. To further investigate SEL1L's role in dislocation, I performed a biochemical search for SEL1L-interacting proteins. I identified OS9, AUP1, and UBXD8 as part of the dislocation machinery. Furthermore, I identified an ER membrane bound ubiquitin conjugating E2 enzyme, UBC6e, as required for HC dislocation in US11 cells. We designed dominant negative versions of UBXD8 and AUP1 by constructing C-terminal fusions with GFP. Expression of these constructs leads to inhibition of HC dislocation in US11 cells. OS9, the ortholog of yeast Yos9p, a protein involved in dislocation of glycosylated proteins, does not appear to be involved in HC dislocation. Overexpression of OS9 mutants in which the putative lectin binding domain of OS9 was disrupted, as well as overexpression of wild-type OS9 frustrate dislocation of RI332, but have only a very mild effect on HC dislocation. This result suggests that US11 assumes the role of OS9 in substrate recognition and selection. Further analysis of UBC6e led to an intriguing connection between proteins involved in ER dislocation and immune function, possibly cross-presentation. UBC6e is highly expressed in dendritic cells and can be phosphorylated upon ER stress. I found that UBC6e can be quantitatively phosphorylated upon stimulation with various Toll-like receptor (TLR) ligands, and that this phosphorylation is dependent on an intact toll-like receptor signaling pathway. Dendritic cells from mice with compromised TLR signaling do not show phosphorylation of UBC6e. The observed cross-talk between chemicals that induce ER stress and between agonists of TLR signaling uncovers new aspects of TLR biology.

In Eukaryoten werden ein Drittel aller Proteine ins endoplasmatische Retikulum (ER) eingeschleust. Bei diesen Proteinen handelt es sich um sekretorische oder membrangebundene Proteine. Im Inneren oder Lumen des ER herrscht ein oxidatives Milieu, das zusammen mit bestimmten Enzymen und Chaperonen die richtige Proteinfaltung begünstigt. Dabei durchlaufen Proteine einen Faltungszyklus, erhalten N-verknüpfte Glykane und verbinden sich zu Multiproteinkomplexen bevor sie das ER in Richtung Golgi verlassen dürfen. Der Faltungszustand jedes einzelnen Proteins wird genau überwacht und überprüft, und nur solche Proteine, die einen gewissen Qualitätsstandard erfüllen, dürfen das ER verlassen. Eine Anhäufung irreversibel misgefalteter Proteine bedroht das Gleichgewicht im ER und kann zum Zelltod führen. Deswegen werden solche Proteine, die irreversibel missgefaltet sind, aus dem ER heraus ins Zytosol zurücktransportiert (disloziert) und dort vom Proteasom abgebaut. Dieser Prozess heisst auch ER assozierte Degradation. Zytomegaloviren, die den Menschen befallen (human cytomegalo virus, HCMV), kodieren für zwei Transmembranproteine (Typ I) im ER, US2 und US11. Diese beiden Proteine machen sich die zelluläre Dislokationsmaschinerie zu eigen, um den Abbau der schweren Kette des Histokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) Klasse I zu initiieren. Durch die Entfernung von MHC Produkten von der Zelloberfläche können virusbefallene Zellen nicht mehr von den zytotoxischen T Zellen des Immunsystems erkannt und eliminiert werden. US2 und US11 haben beide zum Ziel, die gleichen Proteine (die schweren Ketten des MHC Klasse I) zu entfernen. Dieses Ziel erreichen sie allerdings mit verschiedenen Methoden: US2 rekrutiert SPP (signal peptide peptidase) um Klasse I MHC zu entfernen, während US11 einen von Hefe zu Mensch konservierteren Weg wählt: das polytopische Transmembranprotein Derlin-1, ein Homolog von Der1p aus Hefe, bindet an US11 und wird für die Zerstörung des Klasse I Moleküls benötigt. Derlin-1 kann mit einem weiteren Protein aus der Derlin-Familie, Derlin-2, Oligomere bilden. Derlin-2 bildet einen Komplex mit der ATPase p97 und mit den Orthologen des Hrd1p/Hrd3p Ligasekomplexes aus Hefe. Die vorliegende Doktorarbeit untersucht das humane Ortholog von Hrd3p, SEL1L, und welche Rolle dieses Protein in US11-induzierter und allgemeiner Dislokation spielt. SEL1L ist ein fünffach glykosyliertes Transmembranprotein vom Typ1. Der Grossteil des Proteins befindet sich im Lumen des ER, und besteht aus wiederholten Domänen der Tetratricopeptidfamilie, die an der Erkennung misgefalteter Peptide beteiligt sind. In dieser Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass SEL1L essentiell für den Abbau von Klasse I MHC Molekülen in Zellen ist, die US11 exprimieren, aber nicht in Zellen, die US2 exprimieren. Desweiteren konnte ich zeigen, dass SEL1L unabhängig von Virusprodukten für die Degradation einer misgefalteten kürzeren Version von Ribophorin, RI332, verantwortlich ist, und ausserdem spezifisch an das misgefaltete RI332 und nicht an das normal gefaltete Ribophorin bindet. Mit biochemischen Methoden bestimmte ich Interaktionspartner von SEL1L. Die neuen Proteine OS9, AUP1, und UBXD8 sind alle Teil der Dislokaktionsmaschinerie, die sich US11 zu eigen macht. Ausserdem identifizierte ich ein membrangebundenes Ubiquitinkonjugations-enzym UBC6e, das nötig ist für die Zerstörung von Klasse I MHC Molekülen in US11-exprimierenden, aber nicht in US2-exprimierenden Zellen. Wir entwarfen dominant-negative Versionen von AUP1 und UBXD8, indem wir den C-terminus mit einem GFP tag fusionierten. Diese Konstrukte führen zu einem Arrest der Klasse I MHC Moleküle in der ER Membran. OS9, das ortholog von Hefe Yos9p, ein Protein das an der Degradation von glykosilierten Proteinen beteiligt ist, scheint keine Rolle am Abbau von Klasse I Molekülen zu spielen. Die Überexpression von OS9 Mutanten, die die angebliche Lektinbindedomäne zerstören, sowie Überexpression von Wildtyp OS9 –wahrscheinlich aufgrund eines Ungleichgewichts des Dislokationskomplexes- inhibieren die Dislokation von RI332, aber haben nur einen sehr geringen Effekt auf den Abbau von Klasse I MHC Molekülen. Eine weiterführende Analyse von UBC6e erbrachte eine interessante Verbindung zwischen Proteinen, die eine Rolle beim Abau von ER Proteinen spielen, und Proteinen, die eine Rolle in der Immunfunktion spielen. UBC6e wird stark in dendritischen Zellen exprimiert und kann nach der Induktion von ER Stress phosphoryliert werden. Wir fanden heraus dass UBC6e quantitativ phosphoryliert werden kann, wenn man dendritische Zellen mit verschiedenen Liganden von Toll-like Rezeptoren (TLR) stimuliert. Dendritische Zellen aus Mäusen die eine Mutation in einem der Proteine der TLR Signalkaskade haben, zeigen keine UBC6e Phosphorylierung mehr. Ein Zusammenhang zwischen Chemikalien, die ER Stress induzieren, und Liganden, die TLRs aktivieren, ist noch unbekannt.