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Autor(en): Altintoprak, Klara
Titel: Virale Nanoringe für die Integration in Biohybrid-Systeme
Sonstige Titel: Bioengineered viral nanorings for the insertion into bio-hybrid systems
Erscheinungsdatum: 2016
Dokumentart: Dissertation
Seiten: 199
URI: http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/9868
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-98683
http://dx.doi.org/10.18419/opus-9851
Zusammenfassung: Filtereinheiten mit nanoskopischer Porengröße werden zunehmend für medizinische Anwendungen und analytische Verfahren eingesetzt. DNA-Moleküle lassen sich bereits durch Nanoporen sequenzieren, und auch für schnelle und exakte Analysen niedermolekularer Substanzen bergen sie ein hohes Potential. Besonders schwierig ist es allerdings, nanoporöse Membranen mit Millionen von identischen Poren herzustellen. Hybridmembranen könnten hier einen Ausweg bieten, indem sich selbst organisierende biologische Komponenten als "Porenadapter" in poröse anorganische Festkörpermembranen (solid-state membranes, SSMs) integriert werden. Die biologischen Einheiten definieren dann Durchmesser und physikochemische Eigenschaften der effektiven Poren und damit die Selektivität der Filtermembran. Im Rahmen dieses Promotionsprojekts wurde ein neuer stabiler, aber zugleich auch genetisch und chemisch leicht manipulierbarer Porenadapter aus Pflanzenvirusbausteinen entwickelt und für die Insertion in SSM-Poren erprobt und optimiert. Er ist sowohl an seinem äußeren Rand, als auch im Innenkanal spezifisch funktionalisierbar. Als Ausgangsmaterial diente das pflanzenpathogene Tabakmosaikvirus (TMV), ein Nukleoprotein-Röhrchen, das aus einem einzelsträngige (ss)RNA-Molekül und ca. 2130 Hüllprotein-(coat protein, CP)- Untereinheiten besteht. Sowohl die Länge der Partikel, gesteuert über die RNA- Länge, als auch die Protein-Sequenz des CP sind leicht manipulierbar, weshalb TMV zu einem beliebten multifunktionalen Nanobaustein in Hybridmaterialien avanciert ist. Der neuartige Porenadapter aus TMV-Komponenten wurde speziell an die Insertion in eine SSM mit konisch geformten Poren angepasst, wie sie im Labor von Projektpartnern in Ulm hergestellt wird. Aus einem kurzen RNA-Konstrukt, das über In-vitro-Transkription präpariert wurde, und ca. 68 CPs organisiert sich dieser Adapter selbst als eine vierwindige 10 nm lange Nukleoprotein-Helix, die angesichts ihrer lochscheibenähnlichen Form im Folgenden auch „Disk“ genannt wird. Da die „Disks“ in den SSM-Poren unter leicht alkalischen Bedingungen irreversibel fixierbar sein sollen, wurde ihre Struktur im Bereich von pH 7.2 bis 9.0 untersucht und erwies sich als stabil. Damit waren sie den natürlich vorkommenden ringförmigen RNA- freien TMV-CP-Aggregaten klar überlegen, die innerhalb dieses pH-Regimes oligomerisierten und im alkalischen Milieu zerfielen. Auf Isothiocyanat- funktionalisierten Substraten konnten die RNA-haltigen „Disks“ kovalent immobilisiert werden, sodass alle Voraussetzungen für ihre Integration in SSM-Poren bestanden. Bereits in ersten Kombinationsversuchen ließen sich die „Disks“ mit guter Effizienz in SSM-Porenkanäle inserieren, waren aber in den Poren oft nicht richtig orientiert. Deshalb wurde im zweiten Teil des Projekts ein verfeinertes Adapter-Konstrukt mit einer stark polaren Achse konzipiert, das sich, ausgerichtet in einem elektrischen Feld, in die SSM-Poren einfädeln lässt. Es besteht aus einer Nukleoprotein-„Disk“ mit herausragender freier doppelstängiger (ds)RNA, wodurch es über eine wesentlich höhere negative Ladung als die Porenadapter der ersten Generation verfügt. Dank der spezifischen Interaktion der CPs mit ssRNA konnte ein RNA-Konstrukt, das partiell einzel- und partiell doppelsträngig ist, als Grundgerüst für solche „Disks an der Leine" dienen. In gelelektrophoretischen Analysen zeigten die Produkte tatsächlich eine höhere Mobilität als herkömmliche „Disks“. Ziel ist schließlich eine robuste Hybridmembran, in der biologische Porenadapter irreversibel in die SSM-Kanäle implantiert und Leckströme gering sind. Dies ließe sich durch das Abscheiden von anorganischem Material zwischen SSM-Poreninnenwand und „Disk“-Rand erreichen, wenn die Lücke zwischen beiden Komponenten an der Grenzfläche ortsselektiv versiegelt werden könnte. Dafür sind im letzten Teil der Arbeit „Disks“ mit spezifisch mineralisierbarer Außenfläche entstanden, welche ihre Silikat-Ummantelung aus löslichen anorganischen Vorstufen induzieren. Verschiedene mineralisationsvermittelnde Peptide wurden chemisch an TMV-Partikel gebunden und die SiO2-Abscheidungseffizienzen vergleichend untersucht. Besonders vielversprechend war ein Peptid mit alternierendem Lysin-Aspartat-Motiv, (KD)10C, das auf Grundlage von Literaturdaten entworfen wurde. Es lieferte tatsächlich auch nach Konjugation an „Disk“-Außenflächen ausgezeichnete Ergebnisse: Die so mit Peptiden funktionalisierten „Disks“ bewirkten eine ringförmige Abscheidung von SiO2, was bei unmodifizierten „Disks“ nicht beobachtet wurde. Die neuartigen RNA-stabilisierten und leicht funktionalisierbaren „Disks“ aus TMV- Derivaten sind somit aussichtsreiche biologische Porenadapter zur lipidfreien Insertion in Festkörper-Template. Dank der großen Adaptierbarkeit dieser Nanobausteine könnten davon vielfältige Anwendungen profitieren.
Enthalten in den Sammlungen:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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