Studies on the influence of loop structures on the selective hydroxylation of sesquiterpenes in Rieske Dioxygenases

Abstract

Oxyfunktionalisierte Verbindungen spielen eine zentrale Rolle in der synthetischen Chemie, sei es als Geschmacks- und Duftstoffe, in der Pharmaindustrie oder als Basischemikalien. Besonders bei den Duftstoffen und Pharmazeutika ist die Kontrolle der Selektivität in Oxyfunktionalisierungsreaktionen von großer Relevanz. Jedoch bleibt die selektive Monohydroxylierung und cis-Dihydroxylierung von Arenen ein ungelöstes Problem. Besonders bei Verbindungen mit mehreren ungesättigten Doppelbindungen, wie Sesquiterpenen, ist die Kontrolle der Regioselektivität eine Herausforderung. Wenn die synthetische Chemie an ihre Grenzen stößt, kann die Natur als Vorbild dienen, da Enzyme für ihre hervorragende Selektivitätskontrolle und nachhaltigen Reaktionsbedingungen bekannt sind. Eine vielversprechende Enzymfamilie für Oxyfunktionalisierungen sind die Rieske-non-Häm-Eisen-Dioxygenasen (ROs), die cis-Dihydroxylierungsreaktionen an Aromaten und anderen Substraten sowie allylische Monohydroxylierungen mit hoher Regio- und Stereoselektivität durchführen können. ROs waren das Ziel einiger Enzym-Engineering-Studien, und sind deshalb vielversprechende Mutageneseziele. Ziel dieser Studie war es, das Substratspektrum von ROs auf die sterisch anspruchsvolleren Sesquiterpene auszuweiten, da diese Moleküle und ihre oxyfunktionalisierten Derivate von großem industriellem Interesse sind, beispielsweise als Sandelholzduftstoff Santalol oder Bisabolol-Derivate, die als Pheromone für den Pflanzenschutz eingesetzt werden. Um das Verständnis gegenüber der eingangs erwähnten, hochflexiblen und dynamischen Loop-Strukturen zu verbessern sollten zusätzlich die Loop-Studien von Peter Heinemann aufgegriffen werden, seinen initialen Mutationsansatz für Loops vertiefen und zur besseren Aufklärung molekulardynamische Simulationen einsetzen. Im ersten Teil wurden RO-Wildtypen aus der IBTB-internen Mutantenbibliothek mit den Sesquiterpensubstraten β-Bisabolen 1 und α-Farnesen 2 getestet, wobei die Cumol Dioxygenase aus Pseudomonas fluorescens IP01 als einziges Enzym eine Startaktivität für Bisabolen aufwies. Da die Startaktivität sehr gering war, wurden die Expressionsbedingungen und das Reaktionssystem optimiert, was zu einer 4-fachen Erhöhung der Produktbildung mit β-Bisabolen als Screening-Substrat führte. Im nächsten Schritt wurde der Einfluss von Loop-insertionen und -deletionen auf die Substratspezifität mittels InDel-Scans untersucht, einem in dieser Arbeit entwickelten Screeningverfahren, bei dem alle Aminosäuren eines Loops separat deletiert bzw. ein Glycyl-Prolyl-Fragment zwischen jede Aminosäure eingefügt wird, um eine Screening-Bibliothek zu generieren. Das Screening führte mit β-Bisabolen zu einer interessanten Verschiebung der Regioselektivität, vom Ring-hydroxylierungsprodukt 1a im WT zum terminalen Hydroxylierungs-produktes 1b (Selektivität: 81%) in der Variante I288del. Zur Identifizierung der Produkte durch präparative Biotransformationen wurden verschiedene Bedingungen getestet, die Produkte isoliert und mittels NMR-Analyse charakterisiert (1a: 17 mg, 0.77 mmol, 38,5%; 1b: 24 mg, 0.11 mmol, 54.5%). Um ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden enzymatischen Mechanismen der Selektivitätsverschiebung zu erlangen, wurden molekulardynamische Simulationen in Zusammenarbeit mit den Loschmidt Laboratories in Brünn, Tschechische Republik, durchgeführt. Für den Wildtypen und die Variante I288del wurden molekulardynamische Simulationen mit dem freien Enzym und mit Enzym-Ligand-Komplexen simuliert. Die Simulationen lieferten wertvolle Einblicke in die enzymatischen Eigenschaften: Die B-Faktoren des freien Enzyms und der Enzym-Ligand-Komplexe zeigten, dass die Variante I288del ein rigideres aktives Zentrum besitzt, was den Liganden potenziell besser stabilisieren kann. Zusätzlich ergab die CAVER-Analyse des Substratzugangstunnels, dass der Tunnel jetzt häufiger offen ist, so dass das Substrat leichter in das Enzym eindringen kann, was zu einer höheren Produktbildung führt. Die Analyse der Abstände zwischen dem katalytischen Eisen und den reaktiven Kohlenstoffen im Substrat zeigte, dass der reaktive Schwanzkohlenstoff in der Variante näher am Eisen liegt, was potenziell zu reaktiverenKonformationen führt. Über abschließende adaptive steered molecular dynamics Simulationen, wurden Einblicke in den energetischen Ligandentransport entlang des Substratzugangstunnels erhalten. Diese Simulationen zeigten, dass das Substrat im Wildtyp bevorzugt mit dem Ring zuerst in das Enzym eindringt, was zu einer Ringkonformation im aktiven Zentrum führt. In der Variante I288del ändert sich dies, da der Ligand stark bevorzugt mit dem terminalen Kohlenstoff zuerst in das Enzym eindringt, was zu tail-Konformationen im Enzym und einer starken Präferenz für das terminale Hydroxylierungsprodukt führt. In einem zweiten experimentellen Teil sollte die Produktbildung des terminalen-Hydroxylierungsprodukts 1b durch gezielte Modifikation des aktiven Zentrums mittels Sättigungsmutagenese weiter gesteigert werden, um die Positionierung des Substrats in der aktiven Tasche zu optimieren. Dies führte zu zwei neuen Varianten, I288del_A321T (V1) und N279T_I288del_A321T (V2), mit hoher Selektivität und Produktbildungen von 1,35 mM bzw. 1,58 mM, während die Variante I288del 1,25 mM umsetzte. Weitere Runden der Sättigungsmutagenese führten jedoch weder zu einer Steigerung der Produktbildung noch der Selektivität. Zudem wurden die Sesquiterpene Santalen, Bergamoten, Valencen und Germacren D, welche ursprünglich vom Wildtyp nicht umgesetzt wurden, mit den neu generierten Sättigungsvarianten I288del, V1 und V2 untersucht. Mit diesen Varianten gelang es, drei der vier Substrate umzusetzen. Besonders bemerkenswert war, dass Santalen zu dem industriell relevanten Santalol mit einer GC-Konversion von 0,74 mM umgesetzt werden konnte, was in Zusammenarbeit mit der Firma Isobionics (Geleen, NL) zu einem Patent führte. Im nächsten Teil wurde der InDel-Scan weiter ausgebaut, indem die CDO InDel-Bibliothek mit zwei weiteren Substraten, (R)-Limonen und 2-Phenylpyridin, gescreent wurde. Hierbei lagen Selektivitätsverschiebungen, Generalistenvarianten und erhöhte Produktbildung im Fokus. Mit beiden Substraten wurden Varianten mit erhöhter Selektivität, Aktivität oder neuen Produkten gefunden. Um die Anwendbarkeit nicht nur auf Substratebene, sondern auch auf Enzymebene zu untersuchen, wurde ein weiteres Enzym, die Naphthalin-Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4, getestet. Vier active site-Loops wurden ausgewählt und mit dem InDel-Scan mutiert, was zu einer Bibliothek von 56 Varianten für das Screening mit (R)-Limonen und 2-Phenylpyridin führte. Die Ergebnisse ähnelten den Ergebnissen des Screenings mit dem CDO, zeigten jedoch mehr inaktive Varianten und nur wenige starke Selektivitätsverschiebungen. Einige Varianten zeigten ein komplett verändertes Produktspektrum oder starke Zunahmen in der Produktbildung, und bei 2-Phenylpyridin als Substrat trat mit den InDel-Varianten sogar ein völlig neues, unbekanntes Produkt auf. In einem abschließenden Abschnitt sollte ein direkter Vergleich zu einer computerbasierten Loopmutagenese durchgeführt werden. In Zusammenarbeit mit den Loschmidt Laboratories wurde ein Looptransplantationsansatz unter Verwendung des LoopGrafter-Webtools getestet, welches Loops verschiedener Enzyme vergleicht und Positionen für die Transplantation vorschlägt. Vier verschiedene Designs wurden kloniert und getestet, wobei keine Produktbildung beobachtet wurde. Die Designs wurden überarbeitet, um ihre Stabilität zu erhöhen. Die Expression des Proteins war erfolgreich, aber erneut konnte keine Aktivität festgestellt werden. Zusammenfassend gelang es, im Rahmen dieser Arbeit, Sesquiterpene mit ROs in angemessenen Ausbeuten umzusetzen, wobei sogar Milligramm-Mengen zur Produktidentifizierung erreicht wurden. Eine vollständige Selektivitätsverschiebung in der Hydroxylierung von β-Bisabolen von Ring- zu Terminal-Hydroxylierung wurde erzielt. Die computergestützte Studie lieferte wertvolle Einblicke in den Ligandentransport in ROs und die durch die Loop-Mutation I288del vermittelten Mechanismen, welche zum Selektivitätsshift führten.