Klonierung, Expression und Charakterisierung der Cytochrom P450-Monooxygenase CYP102A3 aus Bacillus subtilis sowie Veränderung ihrer Regioselektivität durch gerichtete Evolution

Abstract

Cytochrom P450-Monooxygenasen sind in der Natur weit verbreitet und besitzen Schlüsselfunktionen im Metabolismus exogener und endogener Verbindungen. Funk-tionell ist allen P450-Enzymen gemeinsam, Sauerstoffatome auf nicht aktivierte aliphatische oder aromatische C-H, N-H oder S-H-Bindungen zu übertragen. Die funktionelle Vielfalt der durch P450-Systeme katalysierten Monooxygenierungen von auf chemischem Wege häufig nur schwer zugänglichen Verbindungen bietet ein enormes biotechnologisches und pharmakologisches Potential. Eine wichtige Voraussetzung zur Nutzung dieser Potentiale ist die Entwicklung geeigneter Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsnachweissysteme, die erlauben P450-Systeme zu charakterisieren und Enzymvarianten mit verbesserten Eigenschaften aufzufinden. Es existieren bereits zahlreiche Untersuchungen zur bakteriellen Fettsäurehydroxylase CYP102A1 aus Bacillus megaterium, die viel versprechende Eigenschaften in Bezug auf Aktivität und Stabilität im Vergleich zu eukaryontischen Systemen aufweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine weitere bakterielle Monooxygenase der P450-Familie CYP102 kloniert und in E. coli funktionell exprimiert. Bei der Charakterisierung der P450-Monooxygenase CYP102A3 aus Bacillus subtilis wurde entdeckt, dass sie höhere Stabilität bei Raumtemperatur und in Lösungsvermittlern aufweist als CYP102A1 und damit für technische Anwendungen geeigneter erscheint. Durch Mutagenese wurde die Substratspezifität stark erweitert und auf Alkane und Arene ausgedehnt. Um die Regioselektivität der n-Octan-Hydroxylierung durch Mutagenese von rein subterminaler zu terminaler Hydroxylierung zu ändern, wurde ein Hochdurchsatzassay entwickelt, der selektiv für terminale Hydroxylierungen an aliphatischen Verbindungen ist. Er beruht auf der Oxidation des entstandenen primären Alkohols zum Aldehyd durch eine Hefe-Alkoholdehydrogenase. Mit Hilfe des Assays und der Methode der gerichteten Evolution konnte aus 6500 Mutanten eine terminal hydroxylierende Variante identifiziert werden, deren Sequenzinformationen die Erstellung einer stabilen Doppelmutante auf der Basis von CYP102A3 ermöglichte, welche bei der Hydroxylierung von n-Octan einen Produktanteil von 48% 1-Octanol liefert. P450 monooxygenases play a key role in primary and secondary metabolic pathways and in drug detoxification. Cytochromes P450 are heme-thiolate proteins which are widely distributed in animals, plants and microorganisms. Their unique hydroxylation capacity provides the opportunity to use these biocatalysts for the synthesis of fine chemicals, as they even act on non-activated carbon-hydrogen bonds and hydroxylate such compounds as alkanes, fatty acids, terpenes and steroids, often exhibiting high regio- and stereoselectivity. A very important premise for using this potential is the development of expression, purification and activity test systems that provide the possibility to characterize enzyme variants with enhanced properties. There exist many publications about the bacterial fatty-acid hydroxylating P450 CYP102A1 from Bacillus megaterium. This enzyme shows very promising properties regarding activity and stability compared to eukaryotic systems. During the work presented here another bacterial monooxygenase of the CYP family 102 was cloned and actively expressed in E. coli. The characterization of this P450 enzyme (CYP102A3) from Bacillus subtilis showed higher stability at room temperature and in co-solvents than CYP102A1. This makes the enzyme more suitable for technical applications. Using mutagenesis, the substrate specificity was enlarged and incorporates now also alkanes and arenes. To change the regioselectivity of the octane hydroxylation from subterminal to terminal position, a HTS assay was developed that is selective for terminal hydroxylation of aliphatic compounds. It is based on the oxidation of the primary alcohol developed during the hydroxylation reaction by yeast alcohol dehydrogenase. Using this assay combined with directed evolution, a gene bank of 6,500 enzyme variants was screened. A terminal hydroxylating mutant was discovered and sequenced. The sequence information was used to create a new, more stable variant of CYP102A3 which yields up to 48% 1-octanol after octane hydroxylation.