Strategies for rational protein engineering of cytochrome P450 monooxygenase systems

Abstract

Cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) constitute a large and diverse protein family. Because of their ability to introduce molecular oxygen into non-activated C-H bonds, CYPs are interesting enzymes for synthetic applications. However, stability, selectivity and activity are often obstacles prohibiting those enzymes from being used in industrial processes. Thus, novel protein engineering strategies for overcoming all those bottlenecks are required. In this work, a comprehensive guide to protein engineering of CYPs covering those three aspects was established to aid rational protein engineering of enzymes with and without known structure. The described protein engineering strategies are based on new insights into CYPs, which were gathered from incorporation of new functionalities into and analyses of the Cytochrome P450 Engineering Database (www.CYPED.BioCatNet.de), as well as molecular modeling of stereoselectivity in CYP101A1 from Pseudomonas putida. The described strategy for improving protein stability is based on the insights gathered from a systematic sequence-based protein stabilization of bovine adrenodoxin reductase. The presented strategies for protein engineering of selectivity are based on the identification of universal selectivity determining positions by systematic literature mining and on new insights from molecular modeling of stereoselectivity. The strategies for protein engineering of activity are based on the amino acid conservation analysis of CYPs, identification of the redox partner interaction sites, and a strategy for re-designing linker regions in artificial CYP fusion systems.

Die Cytochrom P450-Monooxygenasen formen eine große und diverse Proteinfamilie. Aufgrund ihrer Fähigkeit molekularen Sauerstoff in nicht-aktivierte C-H-Bindungen einzufügen, sind Vertreter dieser Familie von zunehmendem industriellem Interesse. Ihre Anwendbarkeit in nicht-physiologischem Umfeld wird jedoch häufig durch mangelnde Stabilität und ungeeignete Selektivitäten und Aktivitäten eingeschränkt. Zur Überwindung dieser Einschränkungen besteht daher Bedarf an neuartigen Strategien des Protein-Engineerings. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein umfangreicher Leitfaden zur Anpassung von Stabilität, Selektivität und Aktivität von Cytochrom P450-Monooxygenasen an die Anforderungen synthetischer Anwendungsfelder entworfen. Dieser Leitfaden enthält Strategien zur Optimierung von Enzymen mit bekannter wie auch mit unbekannter Struktur. Die vorgestellten Strategien beruhen auf neuen Erkenntnissen über Cytochrom P450-Monooxygenasen, die in dieser Arbeit durch Einsatz verschiedener Methoden gewonnen werden konnten: durch Einbindung neuer Funktionen in die Cytochrome P450 Engineering Database (www.CYPED.BioCatNet.de), deren Aktualisierung und Analyse, sowie durch molekulare Modellierung der Stereoselektivität in der CYP101A1 aus Pseudomonas putida. Ausgehend von einer systematischen, sequenz-basierten Stabilisierung der Rinder-Adrenodoxin Reduktase beschreibt diese Arbeit eine Strategie zur Verbesserung der Proteinstabilität in Cytochrom P450-Monooxygenase-Komplexen. Die hier beschriebene Strategie zur Modifikation der Proteinselektivitäten beruht auf der Identifikation von universellen selektivitätsbestimmenden Positionen durch systematische Auswertung wissenschaftlicher Literatur und neuen Erkenntnissen durch molekulare Modellierung der Stereoselektivität in P450-Monooxygenasen. Zur Verbesserung der Enzymaktivität beschreibt der Leitfaden eine kombinierte Strategie unter Verwendung einer Analyse der Aminosäure-Konservierung in Cytochrom P450-Monooxygenasen, der Identifikation von Redoxpartner-Interaktionsstellen und der Umgestaltung von Linker-Regionen in artifiziellen CYP-Fusionssystemen.