Entwicklung von humanen organoiden Vollhautäquivalenten für biomedizinische Testsysteme

Abstract

Die Haut ist das erste Organ das künstlich mit Methoden des Tissue Engineering gezüchtet wurde [8]. Hautstrukturen werden überwiegend mit dem Ziel der Gewinnung und Optimierung von Transplantaten für Schwerbrandverletzte oder für schlecht heilende Wunden entwickelt. In der letzten Zeit hat sich ein weiterer Verwendungszweck als in vitro Testsysteme für solche Hautäquivalente entwickelt. Einen entscheidenden Anteil daran hat die vor kurzem verabschiedete 7. Kosmetikrichtlinie, welche vorschreibt, bis zum Jahr 2009 Tierversuche zur kutanen Resorption durch in vitro Tests zu ersetzen. Weiterhin sollen im Rahmen der REACH Verordnung eine große Zahl von Chemikalien auf schädliche Nebenwirkungen getestet werden. Hier stellen Hautäquivalente eine echte Alternative dar. In der Pharmaforschung und ganz besonders beim Screening potentieller Substanzen mit therapeutischem Nutzen sind hoch entwickelte und standardisierte Testsysteme als möglichst human-nahe Indikatoren für den Wirknachweis gesucht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein 3-D Hautmodell, bei dem Keratinozyten luftexponiert auf einer fibroblastenhaltigen Kollagen Typ I-Matrix wachsen und ein der Epidermis ähnliches Epithel mit allen Differenzierungskriterien gut vergleichbar mit Echthaut bilden, als Testsystem etabliert für: I. in vitro Wundheilungsstudien. Durch zelluläre Erweiterung wodurch ein Modell für Untersuchungen im Bereich der II. in vitro Hauttumorbiologie und III. in vitro Angiogenese aufgestellt und letztlich ein IV. in vitro Infektionsmodell für die Untersuchung von Infektionsmechanismen am Beispiel von Candida albicans entwickelt. Als Basis für diese Fragestellungen diente ein 3-D humanes Hautmodell. Für die Etablierung des (I) in vitro Wundheilungmodells wurde das 3-D humane Hautmodell mit einem Erbium-Yag Laser exakt definiert hinsichtlich Geometrie und Energie, verletzt. So konnten in vitro Wunden mit einer einheitlichen und reproduzierbaren Größe hergestellt werden. Mit Zellen aus Biopsien von freiwilligen Spendern wurden Nachweise bzgl. spezifischer Markermoleküle für die Immunhistologie und Real Time PCR etabliert. Die Funktionalität des in vitro Wundheilungsmodells wurde mit unterschiedlichen topisch applizierten Substanzen hinsichtlich ihres Einflusses auf die Reepithelialisierung überprüft. Zur Etablierung des (II) in vitro Tumormodells wurden zunächst unterschiedliche Melanomzelllinien in das Hautmodell integriert. Nach erfolgreicher Etablierung der Einsaatmethode wurden primäre Melanozyten mit dem induzierbaren Proto-Onkogen (Xmrk) konditional transformiert. Durch den Einsatz dieses Konstruktes, das den extrazellulären Teil des EGF-Rezeptors mit der intrazellulären Domäne von Xmrk funktionell kombiniert, sollte eine reversible, d.h. induzierbare Tumorzelllinie erhalten werden, um diese in das Hautmodell zu integrieren. Weiterhin wurde zur Bestimmung erfolgreich transformierter Melanozyten eine Methode zur Zellzyklusanalyse etabliert. Als weiteres Testsystem wurde (III) ein in vitro Modell zur Gefäßneubildung (Angiogenese) etabliert. Dazu wurde das Tumormodell (II) um mikrovaskuläre Endothelzellen erweitert. Damit wird für die Tumorforschung ein Testsystem zur Verfügung gestellt, an dem potentielle Wirkstoffe bzgl. Anti-Angiogenese identifiziert und validiert werden können. Eine verstärkte Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen wurde zunächst durch VEGF-Zusatz verifiziert. Die zusätzliche Integration von Melanomzellen in das um mikrovaskuläre Endothelzellen erweiterte Hautmodell zeigte auch ohne VEGF-Zusatz eindeutig die Bildung kapillarähnlicher Strukturen. Zur Untersuchung der Pathogenitäts- und Virulenzmechanismen von Mikroorganismen wurde ein Testsystem etabliert, mit dem (IV) beispielhaft in vitro die Adhäsion und Invasion unterschiedlicher Candida Mutanten untersucht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass im Kontext der Infektionsforschung solche in vitro Testsysteme geeignete Alternativen zu Tierversuchen darstellen können. Das Modellsystem wurde mit Candida albicans, einem asexuellen Ascomyceten der Gattung Candida, infiziert. Das entwickelte Modellsystem zeigte erste Ereignisse einer invasiven Infektion von Candida albicans auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass C. albicans unspezifisch innerhalb von 30 Minuten in der Hefeform als auch in der Hyphenform an Gewebe- und Implantatsoberflächen adhäriert. Beim Fortschreiten der Hyphenbildung wurde das Durchdringen des Epithels und der Matrix des Modellsystems binnen 48 h beobachtet. Des Weiteren sind individuelle und synergistische Wirkungen von EFG1 und CPH1, zweier Transkriptionsfaktoren von C. albicans, auf ihre Invasions- und Adhäsionseigenschaften in humane Epithelien untersucht worden. Mit organotypischen Kulturen ist es möglich, eindeutig die verschiedenen Invasionsvorgänge unterschiedlicher Candida albicans Stämme zu verfolgen.

The Skin was the first organ to be cultured artificially using tissue engineering methods [8]. Skin tissue models are mostly developed to obtain and optimize grafts for burn victims and patients with wounds that will not heal. Recently another application for such skin equivalents emerged. The 7th amendment of the EU Cosmetics Directive played a crucial role, as it designates that all animal experiments concerning cutaneous resorption are to be replaced by in vitro tests by the year 2009. In line with the REACH Regulation, a large number of chemicals are due to be tested for any harmful side effects. In these cases, skin equivalents offer a real alternative. Highly developed and standardized test systems as mode of action indicators are required in pharmaceutical research, especially for the screening of potential therapeutical substances. In this thesis, a 3-D skin tissue model, with air exposed keratinocytes, growing on a collagen type 1 matrix containing fibroblasts, forming an epithelial structure similar to the epidermis and comparable with real skin, was established as test system for I. In vitro wound healing studies. A model for II. In vitro skin tumor biology studies as well as for III. In vitro angiogenesis studies was created by cellular expansion and finally an IV. In vitro infection model, using Candida albicans, was developed for the study of infection mechanisms. In order to establish the model (I) for in vitro wound healing studies, a human 3-D skin tissue model was lacerated using an Erbium-Yag laser, exactly defined concerning geometrie and energy. Thus it was possible to produce in vitro wounds of a standardized and reproducible size. Detection reactions for specific markers, used in immunohistology and real time PCR, were established with cells obtained from biopsies of voluntary donors. First of all various melanoma cell lines were integrated into the skin tissue model in order to establish an in vitro tumor model (II). After establishing a seeding method successfully, primary melanoma cells were conditionally transformed with the inducible proto-oncogen (Xmrk).Furthermore a method for cell cycle analysis was established to determine successfully transformed melanoma cells. An in vitro model (III) for angiogenesis was established. Microvascular endothelial cells were added to the tumor model for this purpose. By that a test system was made available for tumour research, which makes possible the identification and validation of potentially antiangiogenetic active substances. At first, an increase in the formation of capillary-like structures was verified by the use of VEGF-additive. The integration of melanoma cells into the extended skin tissue model, containing microvascular endothelial cells, showed clearly the formation of capillary-like structures as a prof of concept. In addition a test system was established to study the mechanisms of pathogenicity and virulence of micro-organisms. This test system (IV) was used to study the adhesion and penetration of various Candida mutants in vitro. It was possible to demonstrate, that such in vitro test systems may represent suitable alternatives to animal experiments in the context of infection research. Candida albicans, an asexual ascomycete of the genus Candida, was used to infect the model system. The developed model system showed first signs of a penetrating infection with Candida albicans. Furthermore it could be demonstrated, that C. albicans adheres to tissue- and implant surfaces within 30 minutes in yeast form as well as in hypha form. During the progression of hypha formation, the penetration of the epithelium and the matrix of the model system within 48 h were observed. In addition, individual and synergetic effects of Candida albicans transcription factors EFG1 and CPH1 on their penetration and adhesion qualities in human epithelia were studied. It is possible to clearly trace the different penetration processes of various Candida albicans strains by using artificial organ cultures.