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Klonierung, Expression und Charakterisierung der Cytochrom P450-Monooxygenase CYP102A3 aus Bacillus subtilis sowie Veränderung ihrer Regioselektivität durch gerichtete Evolution
(2004) Lentz, Oliver; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Cytochrom P450-Monooxygenasen sind in der Natur weit verbreitet und besitzen Schlüsselfunktionen im Metabolismus exogener und endogener Verbindungen. Funk-tionell ist allen P450-Enzymen gemeinsam, Sauerstoffatome auf nicht aktivierte aliphatische oder aromatische C-H, N-H oder S-H-Bindungen zu übertragen. Die funktionelle Vielfalt der durch P450-Systeme katalysierten Monooxygenierungen von auf chemischem Wege häufig nur schwer zugänglichen Verbindungen bietet ein enormes biotechnologisches und pharmakologisches Potential. Eine wichtige Voraussetzung zur Nutzung dieser Potentiale ist die Entwicklung geeigneter Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsnachweissysteme, die erlauben P450-Systeme zu charakterisieren und Enzymvarianten mit verbesserten Eigenschaften aufzufinden. Es existieren bereits zahlreiche Untersuchungen zur bakteriellen Fettsäurehydroxylase CYP102A1 aus Bacillus megaterium, die viel versprechende Eigenschaften in Bezug auf Aktivität und Stabilität im Vergleich zu eukaryontischen Systemen aufweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine weitere bakterielle Monooxygenase der P450-Familie CYP102 kloniert und in E. coli funktionell exprimiert. Bei der Charakterisierung der P450-Monooxygenase CYP102A3 aus Bacillus subtilis wurde entdeckt, dass sie höhere Stabilität bei Raumtemperatur und in Lösungsvermittlern aufweist als CYP102A1 und damit für technische Anwendungen geeigneter erscheint. Durch Mutagenese wurde die Substratspezifität stark erweitert und auf Alkane und Arene ausgedehnt. Um die Regioselektivität der n-Octan-Hydroxylierung durch Mutagenese von rein subterminaler zu terminaler Hydroxylierung zu ändern, wurde ein Hochdurchsatzassay entwickelt, der selektiv für terminale Hydroxylierungen an aliphatischen Verbindungen ist. Er beruht auf der Oxidation des entstandenen primären Alkohols zum Aldehyd durch eine Hefe-Alkoholdehydrogenase. Mit Hilfe des Assays und der Methode der gerichteten Evolution konnte aus 6500 Mutanten eine terminal hydroxylierende Variante identifiziert werden, deren Sequenzinformationen die Erstellung einer stabilen Doppelmutante auf der Basis von CYP102A3 ermöglichte, welche bei der Hydroxylierung von n-Octan einen Produktanteil von 48% 1-Octanol liefert.