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Design metabolischer Stoffwechselsysteme am Beispiel der Tryptophansynthese in Escherichia coli
(2006) Schmid, Joachim; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
Zielgerichtete gentechnische Veränderungen, die gewünschte Stoffwechseleigenschaften von Mikroorganismen ermöglichen oder verbessern, haben zur heutigen Wettbewerbsfähigkeit fermentativer Prozesse beigetragen. Da Mikroorganismen komplexe Stoffwechselsysteme darstellen, in denen Eigenschaften des Gesamtsystems über die Eigenschaften seiner Bausteine hinausgehen, können lohnende Ziele für gentechnische Veränderungen häufig nicht intuitiv erfasst werden. Die Formulierung mathematischer Stoffwechselmodelle, die das vorhandene Wissen über den Stoffwechsel von Mikroorganismen sammeln und präzisieren, stellt ein wichtiges Werkzeug dar, die bekannte Komplexität des Stoffwechsels beim Entwurf neuer oder veränderter Stoffwechseleigenschaften im Blick zu behalten. Im Zentrum dieser Arbeit steht die Nutzung metabolisch strukturierter Stoffwechselmodelle zur Identifikation optimaler Kombinationen von gentechnischen Veränderungen. Mathematisch ist diese Designaufgabe als Optimierungsproblem formuliert, bei dem die Zielfunktion eine ausgewählte Produktionsrate darstellt. Dem Systemcharakter des Stoffwechsels wird auf zwei Weisen Rechnung getragen. Erstens wird bei jeder Optimierung das gesamte mathematisch abgebildete Stoffwechselnetzwerk berücksichtigt, zweitens wird durch die gleichzeitige Optimierung mehrerer Designparameter das Wechselspiel unterschiedlicher Eingriffe berücksichtigt. Als Beispielsystem wurde die Tryptophansynthese durch Escherichia coli gewählt. Bezüglich der Formulierung mathematischer Stoffwechselmodelle werden im Rahmen dieser Arbeit zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt, wodurch sich eine Gliederung der Arbeit in zwei Teile ergibt. Im ersten Teil wird ein Modell untersucht, bei dem enzymkinetisch detailliert beschriebene Reaktionsraten verwendet werden. Einzelkinetiken werden verknüpft über die Bilanzen einer durch den Bilanzrahmen festgelegten Anzahl an Metaboliten. Der hier gewählte Bilanzrahmen ist für Modelle dieser Art bereits beachtlich und umfasst mit Glucoseaufnahme, Embden-Meyerhof-Parnas-Weg und Pentosephosphatweg wesentliche Teile des Glucosekatabolismus, sowie vereinfachte Ansätze für die Synthesewege von Chorismat und Tryptophan. Anhand dieses Modells wird eine Analyse der Flusskontrollkoeffizienten sowie eine nichtlineare numerische Optimierung der Tryptophansyntheserate durch Umverteilung von Enzymmengen durchgeführt. Es lässt sich zeigen, dass eine Untersuchung der Flusskontrollkoeffizienten wertvolle Hinweise zu einer Vorauswahl vielversprechender Eingriffsgrößen liefert, die Optimierung des Systems jedoch nicht ersetzen kann. Die kombinierte Optimierung von Teilsystemen stellt sich einer Optimierung des Gesamtsystems als eindeutig unterlegen heraus. Dadurch wird die gängige Praxis des sequenziellen Designs einzelner Stoffwechselwege in Frage gestellt. Auf den Aspekt von Wechselwirkungen zwischen Designparametern wird insbesondere bei der schrittweisen Entfernung von Ratenlimitierungen im Modell eines Hochleistungsstamms näher eingegangen. Mit der verstärkten Versorgung der Synthesewege mit PRPP und DAHP wird das Zusammenspiel zweier wegen der gemeinsamen Kohlenstoffquelle konkurrierender Designansätze in Bezug auf eine optimale Auslegung des Gesamtsystems untersucht. Eine wesentliche Schwäche des im ersten Teil der Arbeit untersuchten Modells stellt das Fehlen von Bilanzen für die Energie-Cometabolite und Reduktionäquivalente dar. Diese Größen lassen sich erst bei deutlich erweitertem Bilanzrahmen adäquat beschreiben. Ansätze für ein dynamisches Modell, das eine Bilanzierung dieser Größen zulässt, werden vorgestellt. Insbesondere die Verwendung eines vereinheitlichten Ansatzes für die Kinetik von Einzelenzymen wird anhand verschiedener publizierter Ansätze diskutiert. Hierbei lassen sich die Vorteile der Linlog-Kinetik gegenüber anderen einheitlichen Ansätzen herausstellen. Ansätze zur Identifikation der Parameter für Modelle, die die Linlog-Kinetik als einheitlichen kinetischen Ansatz für die Beschreibung von Einzelreaktionsraten verwenden, werden diskutiert. Ein formaler Ansatz zur Optimierung reiner Linlog--Modelle wird vorgestellt, der aber gerade für große Systeme und bei der Berücksichtigung von Nebenbedingungen Nachteile gegenüber der numerischen Optimierung aufweist. Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen eine Konsequenz aus dem Zusammenwirken der Einzelkomponenten eines Stoffwechselsystems, nämlich die mögliche Diskrepanz zwischen der Optimierung eines Teilsystems und einer Optimierung des gesamten Prozesses. Durch die große Bedeutung der Wechselwirkung unterschiedlicher Stoffwechselwege wird eine Erweiterung des Bilanzrahmens bis hin zu genomweiten Modellen motiviert.
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Development of a stochastic multi-scale simulation method for the analysis of spatiotemporal dynamics in cellular transport and signaling processes
(2011) Klann, Michael; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
This work focuses on the development of a stochastic simulation. It employs particle tracking methods to elucidate the transport of signaling molecules through the cell. Furthermore the method is extended and applied to analyze vesicle transport between the cellular compartments, especially focusing on the receptor mediated endocytosis which couples signal transduction and membrane trafficking. The simulation is based on Brownian Dynamics, which has the advantage that the solvent - myriads of water molecules in the cell - does not have to be included. Only the molecules of interest diffuse through the virtual cell by performing a random walk in this Monte Carlo method. The cytoskeleton structure and crowding elements are included as stationary obstacles in order to model the structured intracellular conditions. The simulation is able to reproduce the reduced effective diffusion of the in vivo system through these structures. The correct, yet computationally efficient modeling of the (diffusion-limited) reactions in the cell requires an advanced simulation framework. Due to molecular crowding not only the mobility but also the reaction rates are considerably changed under the in vivo conditions. The present work quantifies three factors which determine the effective reaction rate, namely (i) the effect of the excluded volume, (ii) the effect of the reduced mobility, and (iii) the effect of the altered accessibility of the molecules. Ideally the simulation returns the effective in vivo reaction rate if the correct intracellular conditions and the in vitro rate are set as input parameters. Since the different parameters can be easily changed and controlled in the simulation, it can help to understand and bridge the gap between in vivo and in vitro kinetics. The simple and modular principle of the simulation also provides a versatile tool for the analysis of further intra- and extracellular reaction-diffusion processes. The present simulation was applied to signal transduction in the Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathway. Receptors in the plasma membrane of the cell are activated by a ligand, e.g. growth factors. This signal is then transferred to the mobile MAPK molecule via a cascade of molecules. The active (phosphorylated) form of MAPK can then trigger the genes regulating e.g. the growth of the cell. But on the way from the plasma membrane to the nucleus a fraction of the signal is lost due to dephosphorylation reactions - in the extreme case no active MAPK molecule reaches the nucleus. The simulation was used to analyze this signal transduction process covering both the spatial and the stochastic properties. The results show, that the structure and the parameters of the model determine the outcome of the signaling system. The model was also extended to include transport by motor proteins along the cytoskeleton, which can increase the signal strength in the nucleus as predicted by Kholodenko. The stochastic and spatial aspects are of an even greater importance in the field of vesicle transport. The low number of vesicles in a cell leads to high stochastic fluctuations. Furthermore the vesicles have to be guided to their target compartment through the crowded intracellular space. The simulation shows that this requires a specialized transport system in which the membrane trafficking network is aligned with the cytoskeleton structures in the cell. The constraints which limit the functionality of the model lead to valuable insights into the system. The present model also includes the molecular machinery that governs the formation, transport, and targeting of the vesicles - namely coat molecules (COPI, COPII, clathrin), SNAREs (Soluble NSF Attachment Protein REceptors), and motor proteins (Dynein, Kinesin, Myosin). This enables investigating the maintenance of the vesicle machinery, their recycling, and especially the on demand regulation of vesicle formation based on cargo load -- for example in receptor mediated endocytosis. The latter effect leads to a reduction of active receptors in the plasma membrane, thus reducing the signal strength in signal transduction. The simulation is able to couple vesicle transport and signal transduction models in order to investigate this effect. Eventually also the polarization of the cell depends on the targeted vesicle transport. Special proteins adjust the structure of the cytoskeleton based on the information of activated signaling molecules.
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Dynamische Modellierung und Simulation des Arzneimittelmetabolismus in humanen Leberzellen: Identifizierbarkeit, Robustheit und inter-individuelle Variabilität
(2011) Bucher, Joachim; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
Die Effizienz in der heutigen Arzneimittelforschung und -entwicklung ist, bezogen auf das Verhältnis zwischen der Anzahl der potentiellen aktiven Wirkstoffe und der Anzahl der auf dem Markt vertriebenen Arzneimittel sehr niedrig. Diese Ineffizienz beruht darauf, dass mehr als die Hälfte der Wirkstoffe die klinischen Tests nicht besteht, was wiederum auf erhebliche toxische oder geringe pharmakokinetische Eigenschaften zurückzuführen ist. Untersuchungen zum Arzneimittelmetabolismus im Körper spielen eine große Rolle, da Arzneimittel toxische Eigenschaften annehmen können, wenn sie nicht effizient metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden. Die Leber trägt am meisten zum Arzneimittelmetabolismus bei, da Detoxifikationsenzyme, wie die Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYPs) und UDP-Glucuronosyltransferasen (UGTs), in großer Menge in den Leberzellen exprimiert sind und eine hohe inter-individuelle Variabilität aufweisen. Diese Variabilität darf jedoch nicht mit dem therapeutischen Fenster in Konflikt geraten. Daher erfordert diese inter-individuelle Variabilität eine breit gefächerte, auf Populations-Statistiken beruhende Risiko-Abschätzung der Toxizität in der pharmakologischen Forschung. Diese Arbeit, welche sich auf die dynamische Analyse des Arzneimittelmetabolismus in Hepatozyten konzentriert, setzt den Fokus auf die Modellierung des Netzwerkes in Phase I, II und III, in der Modellidentifikation anhand experimenteller Daten auf die Analyse der Parameter-Identifizierbarkeit, welche mit der Robustheit des Systems verknüpft ist, sowie auf die Vorhersage des individuellen Arzneimittelabbaus auf Basis von individuellen CYP- und UGT-Proteindaten. Die Untersuchung des Arzneimittelmetabolismus in dieser Arbeit zeigte, dass Modellierung und Simulation des Metabolismus und der Transportschritte in Leberzellen essentielle Elemente in der Vorhersage der Toxizität darstellen. Von Bedeutende sind vor allem die quantitative Bestimmung der Modellparameter, sowie die qualitative Beurteilung der Parameteridentifizierbarkeit anhand von Sensitivitäten und Korrelationen. Nur eine hochwertige Modellierung erlaubt die Vorhersage der pharmakokinetischen Eigenschaften des Arzneimittels in der Leber, die Prognose des inter-individuellen Ausmaßes und die statistische Analyse in der Bevölkerung. Diese Arbeit zeigte jedoch, dass dieses Isoenzym-System auf Basis von experimentellen Daten an hepatischen Mikrosomen kaum identifizierbar ist, da dieses System insensitive und nicht-identifizierbare Parameter aufweist. Daher zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die detaillierte Untersuchung des Reaktionsnetzwerkes an rekombinanten Isoenzymen vielversprechender und bedeutender ist als an Mikrosomen, in dem Fall, dass mehrere Isoenzyme an dem Abbau eines Arzneimittels zu einem bestimmten Produkt beteiligt sind. Des Weiteren spielen Transportschritte eine wichtige Rolle in der Elimination und der Ausscheidung von Arzneimitteln aus den Leberzellen. Die Modellidentifikation anhand experimenteller Daten an primären humanen Hepatozyten zeigte in ähnlicher Weise zu der Modellverifikation an Lebermikrosomen insensitive und linear korrelierende Parameter in den Transportschritten. Eine Möglichkeit der Modellreduktion auf Basis einer lokalen Parametersensitivitätsanalyse konnte in dieser Arbeit erfolgreich aufgezeigt werden, welche zu sensitiven Parametern führte und damit zuverlässige Modellvorhersagen zulässt. Die Modellverifikation sollte jedoch in Zukunft durch die Implementierung von zusätzlichen Daten aus Untersuchungen an rekombinanten Transportsystemen ergänzt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Vorhersage der inter-individuellen Variabilität auf quantitativen Proteindaten beruht, sollten die zukünftige Verbesserung der quantitativen Bestimmung der CYP- und UGT-Enzyme, sowie die entsprechende Entwicklung von Methoden für die Transportproteine weiter verfolgt werden. Zukünftig sollte ebenso ein Fokus auf die Kopplung des Moduls des Arzneimittelmetabolismus mit den Modulen Zentralmetabolismus und Genregulation gelegt werden, was die holistische Simulation des Arzneimittelmetabolismus in Wechselwirkung mit den anderen Prozessen in der Zelle unter normalen und krankheitsbedingt gestörten Bedingungen erlaubt. Die Vorhersage der Reaktionswege, der Enzympartner und sogar der Modellparameter, sowie deren Verteilung in der Bevölkerung auf Basis von physikochemischen Eigenschaften von Substanzen, wird ebenso eine zentrale Rolle in der Zukunft spielen. Ein weiteres Potential des in dieser Arbeit vorgestellten Modellierungsansatzes liegt in der Implementierung in multi-kompartimentellen physiologisch basierten pharmakokinetischen Modellen. In diesem Rahmen könnten die individuellen in-silico-Vorhersagen verbessert und ein weiterer Fortschritt in der Entwicklung der personalisierten Medizin erreicht werden.
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Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenasen und Prozessentwicklung der enzymatischen Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol
(2008) Samorski, Markus; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
Für die enzymatische Dehalogenierung von 1,2,3-Trichlorpropan zu optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol wurden im Rahmen dieser Arbeit die kovalente Immobilisierung mit dem Enzymträger Eupergit modelliert, die enzymkinetische Charakterisierung der eingesetzten Haloalkan-Dehalogenasen durchgeführt, ein detailliertes Festbettreaktormodell erarbeitet, eine vollautomatisierte Versuchsanlage zur Modellvalidierung und Prozessoptimierung entworfen, gebaut und betrieben, das Langzeitaktivitätsverhalten der beiden Haloalkan-Dehalogenasen untersucht sowie eine Bewertung der eingesetzten Immobilisierungsmethoden vorgenommen. Die Eupergit-Immobilisierung von Haloalkan-Dehalogenase DhaA wurde durch ein kinetisches Modell beschrieben, das aufgrund der Abwesenheit diffusiver Limitierungen die Phänomene Inaktivierung des löslichen Enzyms und Immobilisierungsreaktion in einphasiger Weise beschreibt und einer analytischen Lösung zugänglich ist. Die experimentelle Überprüfung offenbarte eine ausreichende Vorhersagegüte des Modells. Aufgrund der stärkeren thermischen Aktivierung der Immobilisierungsreaktion gegenüber der Enzyminaktivierung führt eine Absenkung der Immobilisierungstemperatur zu sowohl geringeren Enzym-Ausbeuten als auch niedrigeren Raum-Zeit-Ausbeuten der Immobilisierung. Die Ausbeute an aktiv immobilisiertem Enzym kann durch den Einsatz hoher Eupergit-Konzentrationen gesteigert werden. Der Einfluss der Eupergit-Konzentrationen bei der Immobilisierung auf die Reaktorgröße des Syntheseprozesses konnte quantifiziert werden. Die enzymkinetische Beschreibung der Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4, die durch eine Michaelis-Menten-Kinetik mit kompetitiver Produktinhibierung sowohl temperatur- als auch pH-abhängig vorgenommen wurde, konnte die unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften der Enzyme offen legen. Haloalkan-Dehalogenase DhaA zeichnet sich durch eine hohe Affinität zu Substrat und Produkt der betrachteten Dehalogenierung aus (K_M(30°C, pH 9) = 1,79 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 1,56 mmol/l), während das Enzym DSD4 sowohl eine geringere Substrat- als auch Produktaffinität aufweist (K_M(30°C, pH 9) = 9,96 mmol/l, K_I(30°C, pH 9) = 25,6 mmol/l). Auf Basis der kinetischen Daten konnte ein Festbettreaktor als der ideale Reaktortyp für die enzymatische Produktion von optisch aktivem 2,3-Dichlor-1-propanol identifiziert werden. Zur Beschreibung des Festbettreaktors wurde ein detailliertes Modell entwickelt, das zwei Kompartimente unterscheidet und die Phänomene Konvektion, Dispersion, Stofftransport, Diffusion, Adsorption und Reaktion berücksichtigt. Die benötigten Parameterwerte wurden teilweise experimentell bestimmt oder empirischen Korrelationen aus der wissenschaftlichen Literatur entnommen. Das zur Erzielung höherer Produktkonzentrationen erarbeitete Konzept eines Rückführungsprozesses wurde ebenfalls adäquat modelliert. Miniplant-Experimente der immobilisierten Haloalkan-Dehalogenasen DhaA und DSD4 zeigten eine gute Übereinstimmung der experimentellen Beobachtungen und den Simulationsergebnissen. Die Konzentrationsprofile im Festbettreaktor von Fließgleichgewichtsexperimenten werden in erster Linie von den enzymkinetischen Parametern bestimmt, während das dynamische Reaktorverhalten nach einer sprunghaften Änderung der Zulaufbedingungen erheblich von der Substrat- und Produktadsorption am Enzymträger abhängt. Bei den experimentellen Beobachtungen der Prozessvariante mit Rückführung wurde eine Nebenproduktbildung beobachtet, die die Prozessbeschreibung durch das Modell aufgrund zusätzlich verbrauchter Lauge erschwert. Im Falle geringer Nebenproduktbildung kann die Abweichung toleriert und die Vorhersage der zeitlichen Konzentrationsverläufe durch das Modell als ausreichend bezeichnet werden. Die erzielte Raum-Zeit-Ausbeute des Prozesses mit Rückführung entspricht in etwa der des kontinuierlich betriebenen Festbettreaktors bei gleichem Umsatz.
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Isotopisch-instationäre 13 C-Stoffflussanalyse in Escherichia coli
(2007) Schaub, Jochen; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
Die 13C-Stoffflussanalyse ist ein wichtiges Werkzeug im Metabolic Engineering. Ausgangs-punkt dieser Arbeit war der Umstand, dass eine breitere Anwendung der 13C-Stofffluss-analyse, z. B. bei der Analyse der industriell relevanten Prozessführungen Batch und Fed Batch sowie bei tierischen Zellkulturen, bisher insbesondere wegen der eingesetzten GC-MS und NMR basierten Analyse proteinogener Aminosäuren beschränkt ist. Aufgrund der großen Zeitkonstanten infolge eines kleinen Protein-Turnover wird ein quasi-stationärer Zustand in einem für die Stoffflussanalyse interessanten Zeitbereich nicht erreicht. Daher wird diese Vorgehensweise vor allem bei der kontinuierlichen Prozessführung verwendet. Alternativ müssen aufwändige Reaktorkonzepte eingesetzt werden (Drysch et al., 2004). Außerdem bedeutet die erforderliche lange Markierungsdauer hohe experimentelle Kosten. Mittels LC-MS Analysemethoden ist es seit kurzem möglich, intrazelluläre Markierungs-informationen auch direkt auf der Ebene der Metabolite des zentralen Kohlenstoffwechsels zu erheben (van Winden et al., 2005). Wegen des großen Metabolit-Turnover kann auf diese Weise die Zeitdauer eines Markierungsexperimentes erheblich reduziert und damit das Anwendungsspektrum der 13C-Stoffflussanalyse erweitert werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erstmals Messinformationen aus der isotopisch instatio-nären Markierungsdynamik zur Identifikation der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli genutzt werden. Dafür werden Messinformationen zu Absolutkonzentrationen und relativen Massenisotopomerenanteilen benötigt. Für diesen Ansatz der isotopisch instationären 13C-Stoffflussanalyse wurden experimentelle, analytische und rechnergestützte Verfahren entwickelt und eingesetzt. Die Durchführung von Kurzzeit-13C-Markierungsexperimenten erfordert schnelle Probe-nahmetechniken. Hierfür wurde ein neuartiges, auf die LC-MS Analytik abgestimmtes integriertes Probenahmeverfahren entwickelt. Da die Grundoperationen Probentransfer, Abstoppen des Metabolismus, Metabolitextraktion und Probenaufarbeitung indirekt in einem Kapillar-Rohrwendel-Wärmeübertrager ohne jeden Zusatz chemischer Reagenzien erfolgten, konnte die Anzahl der Grundoperationen verringert und durch Automatisierung die Repro-duzierbarkeit verbessert werden. Der Zeitbedarf zur Durchführung dieser Schritte wurde auf 30 s je Probe reduziert. Des Weiteren wurde eine LC-MS Analysemethode für die Quanti-fizierung von intrazellulären Absolutkonzentrationen und von Massenisotopomeren im iso-topisch stationären und isotopisch instationären Zustand entwickelt. Zur Validierung und Ergänzung der LC-MS basierten Bestimmung von Massenisotopomeren wurden GC-MS basierte Messungen freier und proteinogener Aminosäuren durchgeführt. Neben einer geeigneten schnellen Probenahmetechnik und einer LC-MS Analysemethode werden für die isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse auch neue Ansätze in der Simulation von 13C-Markierungsexperimenten und für die Flussschätzung benötigt. Hierfür wurden die Bilanz-gleichungen des Isotopomerenmodells des untersuchten Reaktionsnetzwerkes automatisiert generiert und das resultierende nichtlineare, gekoppelte und steife Isotopomeren-Differentialgleichungssystem numerisch integriert. Als besonders geeignet für eine numerisch stabile Integration erwies sich der Extrapolationsintegrator LIMEX. Dieser kann außerdem isotopisch instationäre Messdatensätze für die nachfolgende Flussschätzung berücksichtigen. Für die Optimierung wurde der Evolutionsalgorithmus JavaEvA verwendet. Die entwickelten experimentellen, analytischen und rechnergestützten Verfahren wurden für die Ermittlung der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli W3110 bei D = 0.1 h-1 ange-wendet. Zunächst wurde dieser Stamm physiologisch charakterisiert. In einem nächsten Schritt wurden intrazelluläre Metabolitkonzentrationen im steady state und nach einem stimulus-response Experiment mittels LC-MS quantitativ bestimmt. Ebenfalls mit LC-MS wurden isotopisch stationäre und isotopisch instationäre Massenisotopomerenverteilungen von Metaboliten des zentralen Kohlenstoffwechsels quantifiziert. Die Bestimmung der Markierungsmuster freier und proteinogener Aminosäuren erfolgte mit GC-MS. Die LC-MS und GC-MS Datensätze wurden im Folgenden zur Durchführung von isotopisch instationären und isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen in E. coli verwendet. Die LC-MS basierte isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse wurde erfolgreich zur Ermittlung der intra-zellulären Stoffflussverteilung in den zentralen Kohlenstoffwechselwegen Glykolyse, Pentosephosphat-Weg und Tricarbonsäure-Zyklus eingesetzt. Als wesentliche Ergebnisse wurden eine Flussverteilung (bezogen auf die Glucoseaufnahmerate) am G6P-Knoten zwischen Glykolyse und Pentosephosphat-Weg von 55% : 44% sowie mit 4% nur eine geringe Aktivität des Malatenzyms bestimmt. Diese Resultate waren in guter Überein-stimmung mit den gleichfalls durchgeführten LC-MS und GC-MS basierten isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen sowie Literaturwerten. Insgesamt ist die Anwendung der entwickelten Methodik bestehend aus integriertem Probe-nahmesystem, LC-MS Analysemethode und isotopisch instationärer 13C-Stoffflussanalyse aussichtsreich für die Bearbeitung von Fragestellungen im Metabolic Engineering, in der Bio-prozessanalyse und -entwicklung, im Hochdurchsatzscreening und für systembiologische Untersuchungen. Dieses erweiterte Spektrum potentieller Anwendungen wird maßgeblich durch die Nutzung der kleinen Zeitkonstanten beim Metabolit-Turnover ermöglicht.
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Systems oriented analyses of hepatic 13C-labeling and metabolite dynamics
(2009) Maier, Klaus; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
In this thesis a data-driven model-based approach was undertaken to analyze the liver central metabolism at the systems-level. The work focused on the model-assisted interpretation of metabolome and fluxome data. Experimental observations of stationary and non-stationary 13C-labeling and metabolite data enabled the identification of metabolic fluxes, metabolite dynamics, and patterns of metabolic control by means of transient 13C-flux analysis, dynamic modeling, and metabolic control analysis. The major goals of this contribution were (i) to establish an experimental set-up and a computational framework for acquiring and analyzing transient 13C-mass fraction data in mammalian cells and to use it to identify metabolic fluxes in HepG2 cells, (ii) to apply transient 13C-flux analysis to quantify the effects of a therapeutic dose of the hypolipidemic drug atorvastatin on the cholesterol pathway and central metabolism in primary rat hepatocytes, and (iii) to provide systems-level analyses of the dynamics and control of the central carbon metabolism in hepatoma cells. The experimental observation of the isotopic transient offers the temporal resolution needed to identify intracellular flux maps in mammalian cells from 13C-labeling experiments. To enable the estimation of metabolic fluxes from non-stationary 13C-labeling data in slow- and non-growing mammalian cell batch and fed-batch cultures, reliable means were provided for simultaneous quenching of metabolism and extraction of intracellular intermediates. The developed sampling procedures and chemical analyses were used to quantify metabolite levels and mass fractions in a dynamic labeling experiment with HepG2 cells using 13C-labeled glucose as substrate. In glycolysis and the pentose-phosphate pathway (PPP), isotopic steady state was reached within 30 min, whereas in the tricarboxylic acid (TCA) cycle isotopic steady state was not attained within 120 min. The experimental data were used to estimate the corresponding flux map. In order to identify the flux distribution, a computational framework was developed. The flux estimation was based on a large-scale stoichiometric model, which was used to estimate effluxes into the biomass, and an isotopomer model of glycolysis, the pentose-phosphate pathway, and the tricarboxylic acid cycle. The split ratio between glycolysis and the pentose-phosphate pathway was determined to 57 % and 43 %. It is worth noting that this was the first time metabolic fluxes were estimated in a mammalian system from a transient 13C-labeling experiment. The effects of a therapeutic concentration of the hypolipidemic drug atorvastatin on cholesterol biosynthesis and central metabolism were determined in primary rat hepatocytes using 13C-labeled glutamine and transient 13C flux analysis. Isotopic steady state was observed within 4 h in the central metabolism but not in the cholesterol pathway, regardless of whether the hypolipidemic agent was administered or not. The flux through the cholesterol pathway was found to drop from 0.27 to 0.08 mmol/(lcv h) in response to the administration of the statin. Only minor differences were determined in the central carbon fluxes between cells treated with 50 nM atorvastatin and untreated cells. The flux control coefficient of the HMG-CoA reductase over the cholesterol synthesis flux was determined to 0.46, i.e. cholesterol biosynthesis is not completely controlled by the HMG-CoA reductase. This means that other reaction steps may be also potent targets for lowering blood cholesterol levels. A dynamic liver central carbon metabolism model was developed from metabolite time-series and applied to break down the control hierarchy in hepatoma cells. The dynamic metabolite data were collected from HepG2 cells in a stimulus response experiment in which the cells had been deprived of extracellular glucose. The enzyme kinetics were described with the canonical linlog formalism, which had been reported previously to yield a good approximation quality, while only requiring the determination of comparatively few parameters. The in silico metabolite time-series data were in accordance with the experimentally determined metabolite dynamics. To unravel the internal control structure of the hepatoma central carbon metabolism, concentration and flux control coefficients, partial flux control coefficients, and internal response coefficients were deduced. The control patterns found support the hypotheses that the glucose-6-phosphate dehydrogenase reaction and the Warburg effect (cancer cells have an increased glycolytic flux in the presence of an adequate oxygen supply) are promising targets for tumor treatment.