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Open Access
Deciphering metabolic pathways in high-seeding-density fed-batch processes for monoclonal antibody production : a computational modeling perspective
(2024) Bokelmann, Carolin; Ehsani, Alireza; Schaub, Jochen; Stiefel, Fabian
Due to their high specificity, monoclonal antibodies (mAbs) have garnered significant attention in recent decades, with advancements in production processes, such as high-seeding-density (HSD) strategies, contributing to improved titers. This study provides a thorough investigation of high seeding processes for mAb production in Chinese hamster ovary (CHO) cells, focused on identifying significant metabolites and their interactions. We observed high glycolytic fluxes, the depletion of asparagine, and a shift from lactate production to consumption. Using a metabolic network and flux analysis, we compared the standard fed-batch (STD FB) with HSD cultivations, exploring supplementary lactate and cysteine, and a bolus medium enriched with amino acids. We reconstructed a metabolic network and kinetic models based on the observations and explored the effects of different feeding strategies on CHO cell metabolism. Our findings revealed that the addition of a bolus medium (BM) containing asparagine improved final titers. However, increasing the asparagine concentration in the feed further prevented the lactate shift, indicating a need to find a balance between increased asparagine to counteract limitations and lower asparagine to preserve the shift in lactate metabolism.
Open Access
Isotopisch-instationäre 13 C-Stoffflussanalyse in Escherichia coli
(2007) Schaub, Jochen; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c.)
Die 13C-Stoffflussanalyse ist ein wichtiges Werkzeug im Metabolic Engineering. Ausgangs-punkt dieser Arbeit war der Umstand, dass eine breitere Anwendung der 13C-Stofffluss-analyse, z. B. bei der Analyse der industriell relevanten Prozessführungen Batch und Fed Batch sowie bei tierischen Zellkulturen, bisher insbesondere wegen der eingesetzten GC-MS und NMR basierten Analyse proteinogener Aminosäuren beschränkt ist. Aufgrund der großen Zeitkonstanten infolge eines kleinen Protein-Turnover wird ein quasi-stationärer Zustand in einem für die Stoffflussanalyse interessanten Zeitbereich nicht erreicht. Daher wird diese Vorgehensweise vor allem bei der kontinuierlichen Prozessführung verwendet. Alternativ müssen aufwändige Reaktorkonzepte eingesetzt werden (Drysch et al., 2004). Außerdem bedeutet die erforderliche lange Markierungsdauer hohe experimentelle Kosten. Mittels LC-MS Analysemethoden ist es seit kurzem möglich, intrazelluläre Markierungs-informationen auch direkt auf der Ebene der Metabolite des zentralen Kohlenstoffwechsels zu erheben (van Winden et al., 2005). Wegen des großen Metabolit-Turnover kann auf diese Weise die Zeitdauer eines Markierungsexperimentes erheblich reduziert und damit das Anwendungsspektrum der 13C-Stoffflussanalyse erweitert werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten erstmals Messinformationen aus der isotopisch instatio-nären Markierungsdynamik zur Identifikation der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli genutzt werden. Dafür werden Messinformationen zu Absolutkonzentrationen und relativen Massenisotopomerenanteilen benötigt. Für diesen Ansatz der isotopisch instationären 13C-Stoffflussanalyse wurden experimentelle, analytische und rechnergestützte Verfahren entwickelt und eingesetzt. Die Durchführung von Kurzzeit-13C-Markierungsexperimenten erfordert schnelle Probe-nahmetechniken. Hierfür wurde ein neuartiges, auf die LC-MS Analytik abgestimmtes integriertes Probenahmeverfahren entwickelt. Da die Grundoperationen Probentransfer, Abstoppen des Metabolismus, Metabolitextraktion und Probenaufarbeitung indirekt in einem Kapillar-Rohrwendel-Wärmeübertrager ohne jeden Zusatz chemischer Reagenzien erfolgten, konnte die Anzahl der Grundoperationen verringert und durch Automatisierung die Repro-duzierbarkeit verbessert werden. Der Zeitbedarf zur Durchführung dieser Schritte wurde auf 30 s je Probe reduziert. Des Weiteren wurde eine LC-MS Analysemethode für die Quanti-fizierung von intrazellulären Absolutkonzentrationen und von Massenisotopomeren im iso-topisch stationären und isotopisch instationären Zustand entwickelt. Zur Validierung und Ergänzung der LC-MS basierten Bestimmung von Massenisotopomeren wurden GC-MS basierte Messungen freier und proteinogener Aminosäuren durchgeführt. Neben einer geeigneten schnellen Probenahmetechnik und einer LC-MS Analysemethode werden für die isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse auch neue Ansätze in der Simulation von 13C-Markierungsexperimenten und für die Flussschätzung benötigt. Hierfür wurden die Bilanz-gleichungen des Isotopomerenmodells des untersuchten Reaktionsnetzwerkes automatisiert generiert und das resultierende nichtlineare, gekoppelte und steife Isotopomeren-Differentialgleichungssystem numerisch integriert. Als besonders geeignet für eine numerisch stabile Integration erwies sich der Extrapolationsintegrator LIMEX. Dieser kann außerdem isotopisch instationäre Messdatensätze für die nachfolgende Flussschätzung berücksichtigen. Für die Optimierung wurde der Evolutionsalgorithmus JavaEvA verwendet. Die entwickelten experimentellen, analytischen und rechnergestützten Verfahren wurden für die Ermittlung der intrazellulären Stoffflussverteilung in E. coli W3110 bei D = 0.1 h-1 ange-wendet. Zunächst wurde dieser Stamm physiologisch charakterisiert. In einem nächsten Schritt wurden intrazelluläre Metabolitkonzentrationen im steady state und nach einem stimulus-response Experiment mittels LC-MS quantitativ bestimmt. Ebenfalls mit LC-MS wurden isotopisch stationäre und isotopisch instationäre Massenisotopomerenverteilungen von Metaboliten des zentralen Kohlenstoffwechsels quantifiziert. Die Bestimmung der Markierungsmuster freier und proteinogener Aminosäuren erfolgte mit GC-MS. Die LC-MS und GC-MS Datensätze wurden im Folgenden zur Durchführung von isotopisch instationären und isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen in E. coli verwendet. Die LC-MS basierte isotopisch instationäre 13C-Stoffflussanalyse wurde erfolgreich zur Ermittlung der intra-zellulären Stoffflussverteilung in den zentralen Kohlenstoffwechselwegen Glykolyse, Pentosephosphat-Weg und Tricarbonsäure-Zyklus eingesetzt. Als wesentliche Ergebnisse wurden eine Flussverteilung (bezogen auf die Glucoseaufnahmerate) am G6P-Knoten zwischen Glykolyse und Pentosephosphat-Weg von 55% : 44% sowie mit 4% nur eine geringe Aktivität des Malatenzyms bestimmt. Diese Resultate waren in guter Überein-stimmung mit den gleichfalls durchgeführten LC-MS und GC-MS basierten isotopisch stationären 13C-Stoffflussanalysen sowie Literaturwerten. Insgesamt ist die Anwendung der entwickelten Methodik bestehend aus integriertem Probe-nahmesystem, LC-MS Analysemethode und isotopisch instationärer 13C-Stoffflussanalyse aussichtsreich für die Bearbeitung von Fragestellungen im Metabolic Engineering, in der Bio-prozessanalyse und -entwicklung, im Hochdurchsatzscreening und für systembiologische Untersuchungen. Dieses erweiterte Spektrum potentieller Anwendungen wird maßgeblich durch die Nutzung der kleinen Zeitkonstanten beim Metabolit-Turnover ermöglicht.