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Auswirkung erhöhter CO2- und HCO-3-Gehalte auf Metabolismus und Energiehaushalt von Saccharomyces cerevisiae
(2019) Eigenstetter, Gerhard; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Diese Arbeit verwendet systembiologische Ansätze zur Analyse zellulärer Reaktionsdynamiken als Folge des CO2 und HCO-3-Anstiegs in Saccharomyces cerevisiae. Sie untersucht zelluläre Prozesse auf der metabolischen und der transkriptionellen Regulationsebene. Die Ausgangsbedingung und die Zustandsänderung werden durch die Prinzipien der Steuer- und Regelungstechnik in datengestützten mathematischen Modellen beschrieben. Beteiligte zelluläre Komponenten werden identiﬁziert und ihr regulatorischer Einﬂuss auf die zelluläre Kontrolle beurteilt. Die angewandten Methoden bieten nützliche Verfahren zur Untersuchung der Signalwirkung von natürlicherweise ubiquitär aber variabel konzentrierten Molekülen wie CO2 und HCO-3. Zusammengefasst zeigen die Resultate die Induktion eines zellulären Signals für pH-Stress, ausgelöst durch steigendes CO2 und den Säurecharakter des damit im Zusammenhang stehenden H2CO3. Die Zellen erhöhen ihre Protonenexportrate und erhöhen dauerhaft die Transkription relevanter Gene. In natürlichen Habitaten wird die notwendige CO2-Menge, abgesehen von Regionen der Tiefsee, wahrscheinlich kaum erreicht. In Bioreaktoren mit mehreren Metern Höhe hingegen beschreiben Fluiddynamiken die Ausbildung horizontaler Flüssigkeitsschichten mit geringer vertikaler Durchmischung. Der hydrostatische Druck erhöht die CO2-Konzentration in den unteren Schichten. Die vertikale Verschiebung von Zellen entlang dieses Gradienten verursacht die Depolarisation der Zellmembran durch die Diffusion von CO2 in diese Zellen. Die Membranspannung ist als Biosignal für Transporter und Kanäle in der Plasmamembran bekannt. Der schnelle Abbau zellulärer Kohlenhydratspeicher beweist die Induktion eines cAMP-Signals in S. cerevisiae als Antwort auf steigende CO2-Niveaus und setzt unter kohlenstofﬂimitierten Bedingungen Glukose frei. Zeitweise kann so in betroffenen Zellen die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien durch cytosolische Substratkettenphosphorylierung ersetzt werden. Die Transkription von Transportern zur Aufnahme von Carbonsäure durch die innere Mitochondrienmembran, auch die von Pyruvat, sind reprimiert, während Gene, die für Proteine des Citratzyklus und der Atmungskette kodieren, induziert werden. Die Oxidation von Fettsäuren ist transkriptionell reprimiert, während die biochemische Synthese von Aminosäuren (Methionin, Leucin, Isoleucin, Valin, Histidin) und Nukleobasen (Purine, Pyrimidine) induziert wird. Die differentielle Expression von bis zu 1763 Genen bestätigt die Beteiligung von 790 Annotationen, welche in der Gen-Ontologie (GO)-Datenbank geführt werden. Das Wesentliche ist, dass CO2 die Synthese, Prozessierung und den Transport von RNA, die Synthese von Ribosomen sowie tRNA fördert und den Sulfatmetabolismus induziert, um wahrscheinlich die posttranslationale Modiﬁkation des Elongationsfaktors II zu erhöhen. CO2 unterdrückt Mitophagie, Autophagie, vakuoläre und peroxisomale Funktionen wie die Proteolyse, Synthese von Polysacchariden und die β-Oxidation. Die Synthese von Alkoholen, die Gluconeogenese und die Sterolsynthese im Cytosol und dem Endoplasmatischen Reticulum sind unter diesen Bedingungen reprimiert. Diese transkriptionelle Antwort wird über 30 Minuten aufrechterhalten. Nach zehn Generationen bei permanenter CO2-Belastung verbleiben weniger als 100 Gene differentiell exprimiert. Das Transkriptionsproﬁl erhöht wahrscheinlich die katalytische Aktivität von limitierenden Reaktionen bei der Purin- und Ribonukleotidsynthese. Die Zellen unterhalten Anpassungen in der mitochondriellen Elektronentransportkette und der oxidativen Phosphorylierung, welche die Hauptfunktionen der zellulären Energiebereitstellung unter aeroben Bedingungen darstellen. Die CO2-Anreicherung beeinträchtigt daher die mitochondrielle Energiebereitstellung, welche nach Pertubation intensiviert wird. Die Maßnahmen stabilisieren essentielle Schlüsselfunktionen für zelluläre Kompartimente (z.B. pH Homöostase) und unterdrücken Mechanismen der Stressantwort. Die vorliegende Arbeit liefert ein Basismodell zur Berechnung der CO2-Konzentration in ideal durchmischten Kultivierungsumgebungen. Einige physiologisch relevante Grenzwerte werden aus diesem Modell abgeleitet. Aktuelle Literatur berichtet bei S. cerevisiae von Energieverlusten, welche bereits durch eine Konzentrationserhöhung um 2 mM CO2 im Medium auftreten. Die vorliegende Arbeit demonstriert i) wann und wie Zellen ihr Transkriptionsproﬁl anpassen und zeigt ii) wie Zellen eine durch CO2 limitierte Energiebereitstellung kompensieren. Dabei wird eine CO2-Umgebung mit 15 mM zwar toleriert, nicht aber vollständig kompensiert. Indessen verursachen 25 mM CO2 einen 15%igen Rückgang der Wachstumsrate und der Biomasse-Substrat-Ausbeute. Die Kohlendioxidkonzentration des Mediums ist daher ein signiﬁkanter Parameter, um Leistungsverluste beim scale-up zu verhindern.
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Bioprocess development for terpenoid production via the methylerythritol phosphate pathway in Escherichia coli
(2022) Patil, Vikas; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
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Bioprocess development with Clostridium ljungdahlii based on metabolic modelling
(2023) Ankenbauer, Maria; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Bacterial synthesis gas (syngas) fermentation offers a promising solution for the reduction of greenhouse gas emissions - the greatest challenge of today’s society. The substrate gas, which mainly consists of CO2, CO, and H2, represents an inexpensive feedstock originating from agricultural, industrial, and municipal wastes. It can be metabolized to a multitude of valuable commodity chemicals and biofuels using different autotrophic bacteria. With syngas fermentation, fossil-based resources are replaced with the simultaneous diminution of the greenhouse gas CO2 and usage of the waste gas CO. In this regard, Clostridium ljungdahlii (C. ljungdahlii) is a good representative of gas-fermenting acetogens, as it is natively endowed to convert syngas components into acetic acid, ethanol, 2,3-butanediol (2,3-BD) and lactate. In addition, C. ljungdahlii is genetically accessible and, therefore, a promising platform for the recombinant formation of high-value products like isobutanol. The autotrophic central metabolism of C. ljungdahlii refers to the Wood-Ljungdahl pathway (WLP), an ancient and energy-limited reductive pathway that relies on a proton gradient for ATP conservation. The conversion of reducing equivalents within this pathway is essential for the establishing of the proton gradient needed for ATP formation, and also for product formation based on several reductive steps starting from CO2. The provision of crucial reducing equivalents depends on the oxidation of the electron source in the substrate gas - CO via carbon monoxide dehydrogenase (CODH) or H2 by a bifurcating hydrogenase (HYD). Hence, for the optimized formation of natural and non-natural reduced products, it is decisive to thoroughly understand the cellular link between energy management, growth, by-product formation, and the electron availability in the substrate gas. In the framework of this thesis, controlled bioreactor batch cultivations with continuous gas supply in 2 L scale were performed to study the growth and product formation of C. ljungdahlii in dependence on varying substrate compositions. In addition, a stoichiometric metabolic model was manually reconstructed for subsequent analysis of intracellular carbon fluxes, redox and energy metabolism using flux balance analysis. Subsequently, the heterologous syngas-based isobutanol production of C. ljungdahlii was investigated. Finally, with regard to the scale-up of syngas fermentations to commercial scales, possible performance losses during CO-based cultivation of C. ljungdhalii in a 125 m3 bubble column reactor were analysed using a kinetic correlation model.
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Construction of robust Escherichia coli strains for large-scale production
(2022) Ziegler, Martin; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
The biotechnical production of many fine chemicals, proteins or pharmaceuticals depends on large-scale microbial cultivations. Due to limited mixing, heterogeneities in process relevant parameters such as nutrient concentrations arise in such fermentations. Escherichia coli (E. coli) is a model organism frequently used in the biotechnological industry. If E. coli is cultivated under heterogeneous conditions, biological reactions of the microorganism result in reduced process performance. Since large-scale fermentations are not economically feasible in academic settings, scale-down reactors that mimic aforementioned heterogeneities are used to investigate heterogenous fermentations. Previous studies in scale-down reactors unraveled that, depending on the process strategy, the unstable supply of a limiting primary carbon or nitrogen source such as glucose or ammonium is one of the underlying causes of process performance loss. Low concentrations of glucose or ammonium elicit the stringent response as a biological starvation reaction which comprises extensive transcriptional reactions. In the first project that contributes to this thesis, the regulatory and transcriptional reactions of the strains E. coli MG1655 and E. coli SR to repeated exposure to ammonium starvation zones were examined in a scale-down reactor. The scale-down reactor followed a two-compartment approach and consisted of a stirred tank reactor and a plug-flow reactor simulating passage through a starvation zone. E. coli SR is a strain with modulated stringent response. It was observed that short-term starvation stimuli do not trigger this regulatory program in E. coli SR and the transcriptional reaction was noticeably reduced. Long-term adaptation of the strain to repeated cycles of limitation and starvation also clearly differed from E. coli MG1655. Despite lack of the stringent response, E. coli SR showed no deficits in the assimilation of the limiting ammonium or in biomass yield on ammonium. In the second project of this thesis, a series of deletion strains with robust phenotype against glucose starvation zones were constructed. Candidate genes were identified and successively removed from the genome of E. coli MG1655 by Recombineering. The fundamental growth parameters of the strains were determined in shaking flask fermentations and no noticeable differences compared to E. coli MG1655 were found. Chemostat cultivations in a scale-down reactor with glucose as the limiting nutrient source revealed that the final strain of the deletion series, E. coli RM214, had a significantly lower maintenance coefficient under heterogeneous conditions than E. coli MG1655. Moreover, in an exemplary heterologous protein productionscenario E. coli RM214 rhaB- pJOE4056.2_tetA proved to be more robust to heterogeneities and showed a significantly higher product yield than E. coli MG1655 rhaB- pJOE4056.2_tetA. In the third project of this thesis, the production of pyruvate in E. coli MG1655 by inhibition of pyruvate dehydrogenase through CRISPR interference was investigated. A central goal was to achieve the stable production in nitrogen-limited conditions. For this, different target sequences in the operon pdhR-aceEF-lpd were tested and the strains cultivated in shaking flask fermentations. All tested target sequences were generally suitable to trigger the accumulation of pyruvate. Combined CRISPR interference against two target sequences did not lead to an increased pyruvate yield in most cases. In addition, the strains E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234 and E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234_pdhR_329 were characterized in two phase fermentations in lab-scale reactors. The initial phase was an unlimited exponential growth phase and was followed by an ammonium-limited production phase. E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234 only produced pyruvate during the exponential phase, and reuptake of pyruvate occurred in the second phase. In contrast, E. coli MG1655 pdCas9 psgRNA_aceE_234_pdhR_329 stably produced pyruvate during the exponential and the ammonium-limited phase and is a potential chassis strain for the growth-decoupled production of pyruvate derived bioproducts. The overarching research issues of the projects were the characterization of strains in heterogeneous conditions and the development of new strategies to improve their performance. The collected data leads me to conclude that the construction of robust microbial strains for large-scale applications is both expedient and feasible. Tailored genetic modifications are the method of choice to achieve this goal. Furthermore, suitable genetic constructs offer promising possibilities for the stable growth-decoupled production of chemicals in nitrogen-limited conditions.
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Development of a novel Escherichia coli production platform with uncoupled stringent response
(2021) Kahlig, Annette Margarete; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Aerobe Kultivierungsprozesse im großskaligen Industriemaßstab werden oftmals durch gegebene technische Grenzen der Fermentationsanlagen limitiert. Die vorliegende Arbeit präsentiert die genetisch modifizierte Mutante E. coli HGT (‘high glucose throughput’) mit einer ausbalancierten Stringenten Kontrolle, welche eine erhöhte Stresstoleranz unter nährstoffreduzierten Bedingungen zusammen mit einer verstärkten Glukoseaufnahme- und Produktbildungsrate in ruhenden Zellen ermöglicht.
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Development, characterization, and application of a novel scale-down apparatus for the investigation of the scale-up dependent CO2/HCO3– stimulus in Corynebacterium glutamicum
(2015) Buchholz, Jens; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Industrial biotechnology is regarded as a key technology for the sustainable production of chemicals and biofuels from renewable raw materials. The economy-of-scale principle leads to a more frequent application of large scale, non-ideally mixed bioreactors of several hundred cubic meters. As a result, the cells are subjected to continuously changing micro-environments along their flow path, such as gradients of the CO2 partial pressure (pCO2), which results due to the tank hydrostatics in exceptional amounts of dissolved CO2/HCO3– towards the bottom of the reactor. This thesis covered the first time investigation of “quasi-stationary” ’low’ (< 40 mbar) and ’high’ (> 300 mbar) pCO2 conditions on the growth kinetics and the transcriptional regulation in Corynebacterium glutamicum . Fermentations performed under ’high’ pCO2 levels resulted in initially enhanced biomass to substrate yields and similar total performance parameters as growth rate and substrate uptake, as well as enzyme activities of selected de-/carboxylating enzymes compared to the reference process. A global comparative transcriptional analysis revealed the importance of the global regulator DtxR (51 % of 117 differential genes) for growth in presence of ’high’ CO2/HCO3– levels, which was corroborated by the significantly reduced growth rate of a delta dtxR mutant. ’Low’ pCO2 led to a bi-level growth behavior with a growth rate reduction of 50 % in phase II. A complex regulatory mechanism in response to ’low’ CO2/HCO3– levels was deduced by combining the results of enzyme activity measurements (two-fold increase of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase activity), by-product formation (L-alanine and L-valine), and DNA microarray analyses (140 differential genes). It is therefore assumed that an amplified expression of thiamin pyrophosphate (TPP) biosynthesis genes occurs to enhance the activity of TPP-dependent reactions to finally increase the availability of CO2 in the cells. The quantitative analysis of processes via carbon balancing is essential for advanced considerations such as flux analysis, especially under different CO2/HCO3– conditions. A novel balancing approach was established by using a total carbon analyzer that considers all carbon species in the liquid phase and in the biomass. Besides leading to completely matched balances of (96–100) %, it prevented false-negative underestimations and allowed the identification and assignment of balance gaps. In addition, it could be shown that considerable amounts of CO2/HCO3– dissolved in the culture medium, even under reference conditions, which in combination with inaccurate biomass carbon contents derived from the literature led to balance gaps of 24 % in the course of fermentations. The quantitative understanding of large scale production environments is an important factor for the rational improvement of bioprocesses. Experimental approaches focus on the abstraction of real bioreactors using specially designed scale-down devices. For this purpose, a novel cascade bioreactor system was developed and established consisting of a 100 L main and two 1 L cascade reactors that can be operated and balanced independently. The successful technical characterization and the verification by model and simulation approaches allowed the defined application of pCO2 gradients (delta pCO2 up to delta 260 mbar) and residence times in the bypass (cascade reactor 1 and 2) in dependence on the mixing and flow characteristics of large scale reactors up to 4 min. At the same time, it could be shown that process relevant secondary parameters such as the temperature and the pH can be kept constant in the course of cultivations. Fermentation experiments were performed using C. glutamicum wild-type and the L-lysine producer DM1933 by considering a mean residence time of 3.55 min and an incremental pCO2 gradient of (75–315) mbar. The phenomenological analysis demonstrated that pCO2 oscillation did not inhibit growth, substrate, and product kinetics compared to the reference process. Furthermore, comparative transcriptional analysis revealed a fast transcriptional response in reaction to the applied pCO2 gradient for the first time. The resulting system response correlated (linearly) in its entirety with the residence time of the cells and the intensity of the pCO2 stimulus. In this regard, 15 differential genes were identified after 1.74 min (delta 75 mbar), whereas 66 differential genes were observed after 3.55 min (delta 240 mbar).
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From stress to acclimation : a systems biology look on the life of Saccharomyces cerevisiae in industrial bioreactors
(2024) Minden, Steven; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Carbon limitation is a fundamental feeding strategy in commercial fermentations guaranteeing efficient substrate-to-product conversion. However, industrial reaction volumes often prevent a microbe from performing optimally. One common source of interference is insufficient mixing resulting in the formation of concentration gradients. For instance, faster microbial consumption versus convective supply depletes the highly diluted limiting substrate locally. The industrial workhorse Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) naturally possesses adaptive mechanisms to cope with substrate depletion. Whether triggered response mechanisms benefit strain performance is doubtful, given that enough substrate is present in an industrial carbonlimited process on average. On the contrary, unnecessary or futile adaptation mechanisms often cause unexpected microbial behavior on large scales. Exploring and elucidating this behavior is the focal point of this thesis. The presented case study employs a stimulus-response approach mimicking a baker’s yeast fermentation snapshot featuring non-ideal starvation zones. In brief, glucose-limited chemostats with two-minute intervals of stopped feeding induce transitions between limitation and starvation. Metabolomic and transcriptomic measurements enable a systems biology analysis of either non-adapted or stimulus-adapted yeasts. One part of this study investigates the haploid laboratory strain CEN.PK113-7D under aerobic conditions. Another part reports gene expression dynamics of the diploid industrial strain Ethanol RedTM under anaerobic conditions. Both strains display robust growth under the tested conditions at the cost of tactic and strategic investments. The laboratory yeast responds to a 110 μmol·L-1 glucose gradient with a modified energy and redox homeostasis. Non-adapted cells perceive this stimulus as a threat, as evidenced by a futile triggering of the environmental stress response causing transient growth rate reduction and increased maintenance demand. Complete adaptation evokes a distinct ‘bioreactor phenotype’ characterized by increased growth capacities and repressed stress response. Results obtained with Ethanol RedTM confirm this stress defense-growth trade-off to be a conserved implication in bioprocesses with fluctuating carbon supply. Altogether, the findings presented in this thesis contribute to a fundamental understanding of how S. cerevisiae operates in heterogeneous commercial-scale fermentations. Finally, the gained knowledge reveals optimization targets for both strain engineering and bioprocess development.
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Globale Metabolomanalyse von Corynebacterium glutamicum : Chancen und Herausforderungen der Gaschromatographie-Massenspektrometrie für das Metabolic Fingerprinting
(2011) Pflug, Simon; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Metaboliten sind niedermolekulare (<1000 Da), organische Verbindungen, die an Stoffwechselreaktionen beteiligt sind. Analog zum Genom oder Proteom bezeichnet man die Gesamtheit aller Metaboliten eines biologischen Systems als Metabolom. Für die wissensbasierte Optimierung industrieller Produktionsstämme ist die Metabolomanalyse eine wichtige Grundlage. Ein aus biotechnologischer Sicht besonders interessanter Organismus ist Corynebacterium glutamicum. Die Produktion von Aminosäuren mit genetisch modifizierten Corynebacterium-Stämmen gehört, bezogen auf die jährlich produzierte Menge, zu den wichtigsten biotechnologischen Prozessen. Aminosäuren werden als Futtermittelzusatz, Geschmacksverstärker und Massenprodukt für pharmazeutische Anwendungen benötigt. Deshalb wird ein tieferes Verständnis des Stoffwechsels und seiner Regulation angestrebt. Für die Metabolomanalyse kommen zahlreiche analytische Methoden zum Einsatz. Von diesen wird die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) allgemein als der Goldstandard bezeichnet. Aufgrund der Trennleistung eignet sich diese Methode zur Trennung komplexer Gemische, wie Zellextrakten. Auf der Seite des Massenanalysators werden meistens Flugzeitmassenspektrometer (Time-Of-Flight, TOF) verwendet. Sie kombinieren eine hohe Scanrate mit einer akkuraten Massenbestimmung über einen weiten Massenbereich (bis mehr als m/z 1000). In dieser Arbeit wurde eine semi-quantitativen GC-MS Analytik etabliert und das Metabolommuster in Zellextrakten von C. glutamicum im ungerichteten Ansatz (metabolic fingerprinting) abgebildet. Auf Seiten des Massenanalysators wurde dafür die Elektronenstoß-Ionisation eingesetzt, um reproduzierbar Fragmentspektren zu erzeugen und zu identifizieren. Im Zuge der Untersuchungen wurden 90 Metaboliten nach Extraktion der polaren und 22 Metaboliten nach Extraktion der lipophilen Metaboliten zweifelsfrei in den Zellextrakten von C. glutamicum identifiziert. Daneben wurde der in der Literatur beschriebene, hohe Anteil nicht identifizierbarer Peaks in den GC-MS Profilen (~50%) bestätigt. Mit Hilfe der vergleichenden Metabolomanalyse konnten signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Stämmen und über den Wachstumsverlauf des Lysinproduzenten DM1933 aufgezeigt werden. Diese fielen geringer aus als erwartet und beschränkten sich zumeist auf Metaboliten des Zentralstoffwechsels und auf Zwischenprodukte, wie Aminosäuren, die unmittelbar oder mittelbar daraus hervorgehen. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde die Chemische Ionisation zur Bestimmung der exakten Molekülionenmasse etabliert. Die Identifikation einer mittels GC-MS bestimmten Masse eines unbekannten Analyten geschieht über den Umweg großer Listen aller möglichen, für diese Masse berechneten Summenformeln. Hierfür wurde mit dem Juelich Mass Analyzer (JUMA) eine Softwarelösung entwickelt, die leistungsfähige Filter mit einer virtuellen Entderivatisierung, einer automatischen Klassifizierung der Summenformeln auf der Basis bekannter Analyten und einem multiplen Datenbankabgleich verbindet. Nach erfolgreicher Validierung auf den Massen bekannter Analyten wurde diese Lösung in Kombination mit stabiler Isotopenmarkierung eingesetzt, um die Herkunft der hohen Anzahl nicht identifizierter Massen im Chromatogramm aufzuklären. Insgesamt konnten so 56 zuvor unbekannte Massen als biologisch relevant und 64 weitere eindeutig als Kontaminationen ohne biologische Relevanz identifiziert werden. Mit diesen Arbeiten ist auch die Voraussetzung für den Zugang zu bisher messtechnisch nicht erfassten Analyten bereitet worden.
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Harmonizing metabolic and spatial compartmentalization for heterologous production of crude violacein in synthetic microbial co-culture
(2024) Müller, Tobias; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
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Identification of key regulatory interactions governing the growth rate in Corynebacterium glutamicum
(2024) Haas, Thorsten; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
The dissertation identifies key regulatory mechanisms governing the growth rate of Corynebacterium glutamicum.
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Interaction between CO2/HCO3- and the iron homeostasis in Corynebacterium glutamicum
(2020) Müller, Felix; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
This work demonstrates, that the chemical iron reduction through phenolic compounds is accelerated in the presence of HCO3-. By that, the intracellular Fe2+ concentration was increased and growth was stimulated in C. glutamicum. Phenolic compounds, which were tested as the reductant in this study, are wide spread in nature and the same habitats can be characterised by high CO2/HCO3- contents. Hence, it can be concluded that the abiotic effect described here impacts other biological as well as geochemical systems.
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Interloping frontiers of systems biology : mass spectrometry in bioprocesses optimization
(2017) Sánchez-Kopper, Andrés; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
System biology as the understanding and prediction of how intracellular machinery works, needs new technological support in order to observe cell metabolism at all its levels. From organism genome to its transcription to proteins and how these proteins regulate metabolite pools as the final response to determined stimuli, are needed to have a close look into specific metabolic states. Mass spectrometry is used here to obtain intracellular information at a metabolomics, peptidomics and proteomics level for specific questions concerning bioprocesses optimization. First, a ZIC-HILIC tandem mass spectrometric method was established to allow the intracellular quantitation of about 50 polar metabolites of the central carbon metabolism without extra derivatization steps, increasing detection limits using alkaline mobile phase, considering “wrong-way-around” ionization, as a basis to perform metabolic flux analysis, needed to evaluate metabolic engineering approaches over titer production. Also, culture performance boosting dipeptide uptake was for the first time revealed by intracellular dipeptide pools quantification in CHO cells, by means of high-resolution mass spectrometry, with which tracking its uptake rates, shows the presence of two possible mechanisms for dipeptide uptake in CHO-DP12 cells. Dipeptide metabolization inside the cell was additionally revealed, as amino acids coming from the dipeptides uptake are directly metabolized or expelled out of the cell proving that, in order to optimize mammalian cells bioprocesses, by means of dipeptide medium supplementation, there is a need to understand specific dipeptide uptake and metabolization. Furthermore, protein turnover of a reference molecular antibody, produced in CHO cells, was also chased by a novel methodology. Out of the traditional stable isotope labeling with amino acids (SILCA), production-like conditions were evaluated, the intracellular mAb degradation was for the first time partially quantified, as intracellular peptides produced by Anti-interleukin-8 monoclonal antibody proteolysis were identified by high-resolution mass spectrometry and the measurement of 13C- labeled L-lysine incorporation in the mAb fragments, during exponential cell growth, allowed the calculation of mAb specific degradation rates, where this approach would lead to quantifying how much product is lost by intracellular proteolysis and how this loss could be controlled under high productivity conditions. By means of mass spectrometry, considering the approaches disclosed in the present dissertation, improved bioprocesses optimization could be reached as we are able to quantitatively observe cell metabolism, from metabolomics to proteomics, allowing further understanding and prediction of biological systems.
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Investigation of growth limitations in (pseudo-)steady states with Corynebacterium glutamicum
(2019) Graf, Michaela; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
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Investigation of high load anaerobic digester design parameters : effect of reaction kinetics on digester design recommendations
(2020) Waelkens, Barbara Elisabeth; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Die anaerobe Vergärung oder Faulung ist ein wesentlicher Bestandteil der Klärschlammbehandlung. Dieser Prozess reduziert und stabilisiert partikuläre und gelöste organische Substanzen, reduziert Gerüche und erzeugt Energie. Die Relevanz des Faulungsprozesses ist eindeutig, jedoch kann das Design von Faulbehältern noch verbessert werden. Heute basieren Auslegungsempfehlungen für Faulbehälter auf empirischen Ansätzen oder Kinetiken erster Ordnung. Diese Ansätze weisen einige Einschränkungen auf: Sie beschreiben nicht die Leistung von Faulbehältern unter Hochlastbedingungen und niedrigen hydraulischen Verweilzeiten, sie unterstützen den Konstrukteur nicht bei der Vorhersage von Auswaschsituationen und sie beschreiben nicht genau die Leistung von zwei in Reihe geschalteten Reaktoren. Diese Arbeit zeigt, dass eine einfache Michaelis-Menten-Typ Kinetik für die Auslegung von Faulbehältern auf Kläranlagen geeigneter ist, wie die Auswertung von Daten anaerober Faulbehälter zeigt. Die vorgestellten Ergebnisse wurden aus den Betriebstagebüchern von 12 anaeroben Faulbehältern auf Kläranlagen ermittelt. Vier Faulbehälter werden als Hochlastfaulungen betrieben und acht Faulbehälter werden als typische Faulungen betrieben. Insgesamt wurden mehr als 40 Jahre Betriebsdaten und 18 verschiedene betriebliche Einstellungen analysiert. Die hydraulische Verweilzeit der 18 ausgewerteten Betriebseinstellungen lag zwischen 5 und 85 Tagen. Die organische Raumbelastung lag zwischen 0,3 kgoTR/(m3*d) und 6,9 kgoTR/(m3*d). Die analysierten Faulbehälter wiesen eine Feststoffkonzentration zwischen 2% TS und 9% TS im Zulauf und eine Feststoffzusammensetzung auf, die durch Primär- und Überschussschlamm beeinflusst wird. Der Umsatz des organischen Trockenrückstands (oTR) (47% bis 68%) und die spezifische Biogaserzeugung pro zugeführtes organisches Substrat (209 l/kgoTRAd - 732 l/kgoTRAd) wurden bestimmt. Der Reaktorwirkungsgrad wurde durch die Gesamtfeststoffentfernungsrate [0,2 kg/(m3*d) - 3,2 kg/(m3*d)] und die spezifische Biogasproduktionsrate [0,15 m3/(m3*d) – 3,4 m3/(m3*d)] ermittelt. Zur Beschreibung der anaeroben Vergärung wurden zwei kinetische Modelle evaluiert: das klassische kinetische Modell erster Ordnung (0,2 1/d ≤ k1st ≤10 1/d) und ein kinetisches Modell auf der Basis der Michaelis-Menten-Kinetik (1 g/l ≤ CM ≤ 10 g/l; 0,12 1/d ≤ kCmax ≤ 0,60 1/d). Die relevanten kinetischen Konstanten wurden aus der Literatur ausgewählt und innerhalb dieses Bereichs angepasst. Eine Sensitivitätsanalyse wurde durchgeführt, um die Relevanz der kinetischen und Prozessparameter zu untersuchen. Innerhalb des untersuchten Bereichs wurde die Leistung des Reaktors am stärksten von der biologischen Abbaubarkeit und der spezifischen Biomassewachstumsrate kCmax beeinflusst. Ein typisches Faulbehälter Design basierend auf der Kinetik erster Ordnung wurde mit einer Michaelis-Menten-Typ Kinetik und mit den Ergebnissen der analysierten Kläranlagen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass bei höheren hydraulischen Verweilzeiten über 20 Tagen, die Kinetik erster Ordnung und Michaelis-Menten-Typ Kinetik beide gleichwertig eingesetzt werden können. Bei niedrigeren Verweilzeiten zeigten Michaelis-Menten-Typ-Kinetiken genauere Vorhersagen. Es war möglich: die Leistungsfähigkeit des Faulbehälters unter hohen organischen Belastungsraten und niedrigen hydraulischen Verweilzeiten zu beschreiben, den Auswaschpunkt vorherzusagen und die Leistung von zwei Faulbehältern in Serie vorherzusagen. Die Möglichkeit, maximale Reaktionsraten und Auswaschphänomene zu berücksichtigen, verbunden mit einer guten Genauigkeit, erlaubt ein erweitertes Verständnis des Optimierungspotentials eines Faulbehälters. Das Verhalten der Hochlastfaulung, zwei hintereinandergeschalteter Faulbehälter und der Schlammrückhaltung lassen sich durch eine Michaelis-Menten-Kinetik genauer beschreiben. Dadurch können Optimierungen abgeleitet und die Auslegung und Steuerung von Faulbehältern erweitert werden.
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Investigation of the impact of different scale-up dependent stimuli on metabolism and population heterogeneity in Corynebacterium glutamicum
(2024) Eilingsfeld, Adrian; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
This thesis investigates the impact of elevated carbon dioxide levels on population heterogeneity in Corynebacterium glutamicum, a widely used industrial production host. Through a series of experiments involving cultivation at varying CO2 partial pressures, flow cytometry, and analysis of DNA content, the research reveals that increased CO2 exerts significant selection pressure, affecting growth rates and cell aggregation tendencies. Key findings indicate that higher growth rates speed up DNA replication levels, while elevated CO2 levels slow them down. The results contribute to understanding how CO2 influences population dynamics, providing insights for optimizing industrial bioprocesses and support Corynebacterium glutamicum as a robust production strain.
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Investigation of the metabolic and energetic states of antibody producing CHO cells for process intensification in fed-batch and perfusion cultivations
(2019) Becker, Max; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
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Metabolic and transcriptomic response to hyperosmotic stimulus reveals strategies for optimization of antibody producing Chinese hamster ovary cells
(2017) Pfizenmaier-Wu, Jennifer; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
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Metabolic compartmentalization in 13C metabolic flux analysis of Chinese hamster ovary cells
(2023) Wijaya, Andy Wiranata; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
Chinese hamster ovary cells is currently a prime focus in mAb production, comprising over 70% of the total approved biologics. The coming patent expiration of blockbuster drugs triggers new market competition for alternative biosimilars. These alternatives create price competition, hence, biosimilar development has been driven by the need to reduce the manufacturing cost. Reducing the manufacturing cost could be achieved by the optimization of the cell lines or cell culture media. For this purpose, OMICS plays an important role, especially to understand cellular metabolism. OMICS technologies provide insights into the cellular capabilities (blueprint) to the actual activities (metabolome/fluxome). This thesis utilized flux analysis to study the metabolism of CHO cells, especially with the use of Carbon-13 (13C Metabolic Flux Analysis). The combination of isotopic non-stationary 13C MFA, compartmented metabolic model, and the sub-cellular metabolome profile allow the quantification of the in vivo mitochondrial shuttles and identification of the sub-cellular fluxes (e.g. isoenzymes). The latter was identified as the bottleneck for improving IgG1 production.
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Metabolic engineering studies with Corynebacterium glutamicum : exploring new ways to produce L-histidine & L-valine
(2019) Schwentner, Andreas; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
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Micro-aerobic production of isobutanol with Pseudomonas putida and investigation of its resilience to substrate limitations
(2022) Ankenbauer, Andreas; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)
The transition from an economy based on fossil resources to a regenerative economy is imminent yet uncertain. Despite an awareness of the scarcity of fossil fuels and the increasing natural disasters due to climate change, the world’s renewable energy supply still constitutes less than 20% of the total energy supply. To reduce humankind’s carbon footprint, next-generation biofuels, such as ethanol or isobutanol, have the potential to revolutionize the transportation energy demand. These biofuels can be produced from renewable feedstock in large bioreactors using microorganisms. However, inhomogeneities, such as carbon or oxygen gradients in large-scale bioreactors, often limit the efficiency of such industrial bioprocesses. The soil bacterium Pseudomonas putida has the potential to supersede existing industrial workhorses like Escherichia coli or Corynebacterium glutamicum due to its natural tolerance towards alcohols, its versatile repertoire of stress responses, and its affinity to a broad range of substrates. This thesis aims to investigate the capability of isobutanol production in P. putida KT2440 and to explore its performance during large-scale stress.