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Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum : Identifizierung und Charakterisierung von Komponenten des Abbaus missgefalteter sekretorischer Proteine
(2003) Hitt, Reiner; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
Das endoplasmatische Retikulum (ER), der Faltungsort von Proteinen des sekretorischen Systems, besitzt ein komplexes Netzwerk faltungsunterstützender und kontrollierender Proteine. Sekretorische Proteine, die ihre endgültige räumliche Konformation jedoch nicht erlangen, werden dem Ubiquitin-Proteasom-System zum Abbau zugeführt. Dieser Prozess wird im Allgemeinen mit ER-Degradation oder ER-assoziierte Degradation (ERAD) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden drei zur endoplasmatischen Proteinqualitätskontrolle gehörende Themengebiete bearbeitet: Als erstes wurde die Klonierung des bisher unbekannten DER7 Gens mit Hilfe der isolierten ERAD Mutante der7-1 durchgeführt. Danach erfolgte eine weitergehende Charakterisierung des Der1 Proteins und der Vergleich mit den Der1-Homologen Ydr411c (S. cerevisiae) und R151.6 (C. elegans). Zuletzt wurde der Einfluss einiger zytosolischer Chaperone auf den Abbau des ERAD Modellsubstrats CPY* untersucht. Die bisher nicht charakterisierte ERAD Mutante der7-1 bewirkt einen verlangsamten Abbau der ERAD Substratproteine CPY* und PrA*. Zusätzlich ist die Beweglichkeit dieser Proteine im elektrischen Feld verringert. Es konnte gezeigt werden, dass dies auf eine defekte Prozessierung der N-Glykoside im endoplasmatischen Retikulum zurückzuführen ist. Durch Kreuzen des der7-1 Allels mit Nullmutanten von Glukosidase I und II, durch Komplementation mit plasmidkodierter Glukosidase I und durch meiotische Kartierung wurde gefunden, dass DER7 mit CWH41 identisch ist. CWH41 kodiert für das Enzym Glukosidase I, welches bei der Prozessierung der Oligosaccharide im endoplasmatischen Retikulum einen terminalen alpha1,2-Glukoserest entfernt. Korrekt getrimmte Oligosaccharide scheinen daher für eine effiziente Proteindegradation notwendig zu sein. Das bestätigt sich durch den, für Doppelmutanten des ERAD und der „unfolded protein response“ (UPR) typischen, temperaturabhängigen Wachstumsdefekt von der7-1 deltaire1 Mutanten. Das Protein Der1 wurde schon in früheren Arbeiten als eine Komponente der ERAD-Maschinerie identifiziert. Bisher wurde jedoch eine Beteiligung nur am Abbau einiger löslicher missgefalteter Proteine nachgewiesen. Durch den Vergleich des Der1 abhängigen Abbaus von löslicher CPY* und membranständigem CTG* (CPY*-Transmembrandomäne-GFP) konnte nun gezeigt werden, dass die Funktion von Der1 unabhängig von der Missfaltung ist und sich wahrscheinlich auf die Degradation löslicher Proteine beschränkt. Eine topologische Charakterisierung von Der1 zeigte, dass der N- und der C-Terminus im Zytosol lokalisiert sind und Der1 insgesamt vier Transmembrandomänen besitzt. Es wurde außerdem gefunden, dass Der1 sehr empfindlich auf Veränderungen am Protein reagiert. Einzig kleinere Modifikationen des C-Terminus, wie das Einfügen eines einzelnen HA-Epitops oder einer N-Glykosylierungs-Konsensussequenz, erhalten die Funktionalität des Proteins. Um potentielle Interaktionspartner von Der1 zu finden, wurde nach High-Copy-Suppressoren der Temperatursensitivität von der1-2 deltaire1 Doppelmutanten gesucht. Es wurden 19 Genbankplasmide erhalten, die im Genbankinsert weder DER1 noch IRE1 enthielten. Ihre Wirkungsweise ist jedoch möglicherweise indirekt, da der Abbau von CPY* durch ihre Expression in der1-2 Mutanten nicht wiederhergestellt wurde. Die fortschreitende Genomsequenzierung ermöglichte inzwischen die Identifizierung einer „Der1-ähnlichen“ Familie mit mehr als 15 Vertretern aus den unterschiedlichsten Organismen. Zwei dieser homologen Proteine sind Ydr411c aus S. cerevisiae und R151.6 aus C. elegans. Das Der1 homologe Protein Ydr411c wurde wegen seiner Zugehörigkeit zur „Der1-ähnlichen“ Familie Dfm1 (Der1-like family member) benannt. Ebenso wie Der1, besitzt Dfm1 einen zytosolischen C-Terminus und ist im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Im Gegensatz zur deltader1 deltaire1 Doppelmutation, führt die deltadfm1 deltaire1 Doppeldeletion jedoch nicht zu temperatursensitiven Hefestämmen. Des Weiteren konnte nur ein äußerst schwacher Einfluss von Dfm1 auf den Abbau des ERAD Substrats CPY* festgestellt werden. Das C. elegans Protein R151.6 hingegen, scheint dieselbe Funktion wie Der1 der Hefe auszuüben. Seine heterologe Expression in deltader1 deltaire1 Doppelmutanten hob die konditionale Letalität dieses Stamms auf. Das deutet darauf hin, dass die Funktion von Der1 auch in höheren Organismen konserviert ist. Als weiteres stellte sich die Frage ob die zytosolischen Chaperone der Hsp90 und Hsp100/Clp am Abbau löslicher ERAD Substrate beteiligt sind. Die in dieser Arbeit getesteten deltahsc82, deltahsp82, deltasti1, deltasba1 und deltahsp104 Nullmutanten zeigten jedoch keinen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit von CPY*. Ob zytosolische Chaperone generell nur beim Abbau von Membransubstraten eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
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The active subunits of the 20S Proteasome in Saccharomyces cerevisiae : mutational analysis of their specificities and a C-terminal extention
(2008) Estiveira, Rui José Cabrita; Heinemeyer, Wolfgang (PD Dr.)
The proteasome is a large multi-subunit complex ubiquitous in eukaryotes and archaebacteria. It contains proteolytic subunits that function simultaneously to digest protein substrates into oligopeptides. In eukaryotic cells, it is involved in the removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, but additionally it has regulatory functions. For example it is responsible for the degradation of cyclins in cell-cycle control and for the destruction of transcription factors or metabolic enzymes in metabolic adaptation. Finally, the proteasome is also involved in MHC (major histocompatibility complex) class I mediated cellular immune response. These cellular functions are linked to an ubiquitin- and ATPrequiring protein degradation pathway involving the 26S proteasome whose proteolytic core is formed by the 20S proteasome. The 20S proteasome has a cylindrical shape and is composed of four rings, each formed by seven α- or seven β-subunits and stacked in the order αββα. In eukaryotic cells, the 20S proteasome is composed of two copies of 14 different subunits, 7 distinct α-type and 7 distinct β-type subunits. Only three of the β-type subunits are proteolytically active and have N-terminal threonine residues acting as nucleophiles. They differ in their major specificities: β5/Pre2, β2/Pup1 and β1/Pre3 are classified as having "chymotrypsin-like", "trypsin-like" and "peptidylglutamyl peptide hydrolysing" (PGPH or caspase-like) activities, respectively. This classification is based on the preferred amino acid residues found at the site of hydrolysis in peptide or protein substrates. These three active β-type subunits have a fixed location in the proteasome, with the two β5/Pre2 copies separated from the clustered β2/Pup1 and β1/Pre3 subunits. In yeast a hierarchy of individual subunit activities for proteasomal function was established: β5/Pre2>> β2/Pup1 > β1/Pre3. Part of this work aimed at clarifying whether this hierarchy is solely dependent on the specificities or whether topological conditions lead to the dominance of the β5/Pre2 activity over the others, which could involve inter-subunit communication mediated by interjacent inactive β-subunits. Stepwise site-directed mutagenesis of key residues forming the substrate binding pockets was used to swap specificities between the yeast β5/Pre2 and β1/Pre3 active sites. Consequences of these mutations were then analysed in regard to maturation of the modified subunits, their specificities towards peptide substrates diagnostic for chymotrypsin-like and PGPH activity and changes in their rank in the hierarchy of functional importance. By mutating the key residue methionine 45 into an arginine, the β5/Pre2 was able to mature and showed some PGPH activity. Combinations with mutant strains, having the other active subunits inactivated, revealed that Pre2 lost its functional dominance. When other key residues were additionally replaced by those present in β1/Pre3 (A20T, V31T, I35T), instead of an further increase in PGPH activity, the β5/Pre2 subunit showed an overall decrease in activity. An unexpected exception was the pre2-M45R-I35T mutant with a strong increase in chymotrypsin-like activity. Maturation of the Pre2 subunit occurred normally like in wild-type in all combinations of mutations tested. When the residue arginine 45 was mutated into a methionine in Pre3, this subunit lost any detectable peptidase activity. Attempts to stabilise the methionine 45 by introducing strategic point mutations at residue 52 were unsuccessful. Additional alterations in the substrate binding site of β1/Pre3 (T20A, T31V, T35I) completely abolished the autolytic maturation and thus any gain of activity. Strains lacking both the Pre3 propeptide and Nα-acetyltransferase were used to confirm that the mutations result in activity loss, even when the autolytic removal of the propeptide was not required. In a second project, the role of the long C-terminal extension of the yeast β2/Pup1 subunit was examined. This 37 amino acid structure embraces the β-ring neighbor subunit β3/Pup3 and reaches the next subunit β4/Pre1. It also contacts β7/Pre6 of the opposite β-ring. Mutations of residues that could loosen contact to the surface of β3/Pup3 (Y204A, R208G and T211A) where without effect. Complete deletion of this extension or truncation of 25 residues was lethal and deletion of the last 20 amino acids caused a strong cell growth defect. When replacing the last 20 amino acids of this C-terminal extension by a FLAG tag, the growth phenotype was lost. The lethal mutations were over-expressed in wild type strains, but the mutated β2 subunits did not incorporate into proteasomes. This indicates that removal of the distal half from the β2/Pup1 C-terminal extension impedes the integration of this subunit during early assembly stages of the 20S proteasome.
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Untersuchungen zur Expression, Funktion und Regulation der ABC-Transporter P-Glykoprotein und Multidrug Resistance Protein 3 beim Menschen
(2003) Hitzl, Monika; Wolf Dieter H. (Prof. Dr.)
Das Ausmaß der Wirkung eines Arzneimittels hängt von seiner Konzentration am Wirkort ab. Zu niedrige Konzentrationen des Wirkstoffes haben keinen erwünschten therapeutischen Effekt beim Patienten. Im Gegensatz dazu bewirken zu hohe Arzneimittelkonzentrationen häufig toxische Nebenwirkungen. Arzneimitteltransporterproteine sind neben Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen für die Pharmakakonzentration am Wirkort verantwortlich. Das Verständnis der Ursachen interindividueller Unterschiede in der Expression solcher Transporterproteine kann somit dazu beitragen, interindividuelle Unterschiede in der Arzneimittelwirkung zu verstehen. In dieser Arbeit wurden zwei ATP-binding cassette Transporterproteine, P-Glykoprotein und Multidrug Resistance Protein 3 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Polymorphismus in Exon 26 des humanen MDR1-Gens (C3435T) mit einer reduzierten P-Glykoproteinexpression und -funktion assoziiert ist. Träger dieses Polymorphismus (3435 TT) zeigten eine niedrigere P-Glykoproteinexpression in Leukozyten als Probanden mit dem CC-Genotyp. Zur Ermittlung der P-Glykoproteinfunktion wurde der Efflux des P-Glykoproteinsubstrates Rhodamin123 aus Leukozyten mit der höchsten P-Glykoproteinexpression (CD56+ NK-Zellen) gemessen. Die P-Glykoproteinfunktion in CD56+ NK-Zellen von Individuen mit dem Genotyp 3435 TT in Exon 26 des MDR1-Gens war signifikant niedriger als bei Individuen mit dem CC-Genotyp. Die Abhängigkeit der P-Glykoproteinexpression vom MDR1-Genotyp wurde auch in Plazenta- und Kolongewebe untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die P-Glykoproteinexpression in humanem Plazentagewebe durch den Polymorphismus C3435T in ähnlicher Weise wie in den CD56+ NK-Zellen beeinflusst wurde. In Fällen, in denen Mutter und Kind den gleichen Genotyp hatten, führte die Mutation in Exon 26 des MDR1-Gens (3435 TT) zu einer 40 %igen Reduktion der P-Glykoproteinexpression in Plazentagewebe. Diese Befunde bedeuten, dass Arzneimittel, welche P-Glykoproteinsubstrate sind (z. B. HIV-Proteaseinhibitoren), niedrigere Konzentrationen in den Leukozyten von Individuen mit dem Genotyp 3435 CC erreichen und somit möglicherweise eine geringere Wirksamkeit haben (z. B. bei HIV). Eine genetisch-bedingte, niedrigere P-Glykoproteinexpression in der Plazenta dürfte die Anreicherung von Xenobiotika im Feten verstärken und könnte somit ein erhöhtes Teratogenitätsrisiko darstellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation von Multidrug Resistance Protein 3 untersucht. Eine Analyse von 62 humanen Lebern zeigte eine erhebliche Variabilität der Multidrug Resistance Proteins 3 Expression. Der Protonenpumpenhemmer Omeprazol wurde als Faktor identifiziert, der zu einer signifikanten Erhöhung der Multidrug Resistance Proteins 3 Expression im Lebergewebe von Patienten führt. Durch in vitro Experimente konnte die Induktion des Multidrug Resistance Proteins 3 durch Omeprazol bestätigt werden. Weitere Experimente zeigten, dass der Aryl Hydrokarbon Rezeptor am Mechanismus der Induktion von Multidrug Resistance Protein 3 durch Omeprazol beteiligt ist. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass Gallensäuren die Expression von Multidrug Resistance Protein 3 in CaCo-2 Zellen induzieren. Da die Expression von ABC-Transporterproteinen häufig in Tumorgewebe induziert ist und somit zur Multidrug Resistance bei der Chemotherapie beiträgt, wurde die MRP3-Expression in Kolon-Tumorgewebe untersucht. Es konnte jedoch bei diesem Tumor eine niedrigere MRP3-Expression im Vergleich zu gesundem Kolongewebe nachgewiesen werden. Mit dieser Arbeit wurden Faktoren identifiziert, die zu einer variablen Transporterprotein-expression beitragen. Das bessere Verstehen dieser Einflussfaktoren könnte somit einen Beitrag zu einer individualisierten, sichereren Arzneimitteltherapie leisten.
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Unterschiedliche Funktionen der Ionenpumpe Pmr1
(2003) Zappe, Andrea; Rudolph, Hans (PD Dr.)
Freies cytosolisches Ca2+ erfüllt in Eukaryonten für viele zelluläre Prozesse die Funktion eines "second messengers" und unterliegt daher einer exakten Kontrolle, um die normale Physiologie der Zelle aufrecht zu erhalten. Auf einen raschen Anstieg der cytosolischen Ca2+- Konzentration erfolgt ein aktives Entfernen des Ca2+ aus dem Cytosol. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae geschieht dies durch die Ca2+- ATPasen Pmc1 und Pmr1, sowie durch den Ca2+/H+ Antiporter Vcx1. Der Weg auf dem überschüssiges Ca2+ wieder aus der Zelle ausgeschieden werden kann, ist bisher unbekannt. Eine Plasmamembran Ca2+- ATPase, wie von Säugerzellen bekannt, scheint in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nicht zu existieren. Da Ca2+ in allen Subkompartimenten des Sekretionswegs eine wichtige Rolle spielt und zu dem dort im Vergleich zum Cytosol in wesentlich erhöhten Konzentrationen nachgewiesen wurde, liegt es nahe zu vermuten, dass Ca2+- verpackt in sekretorische Vesikel - die Zelle durch Exocytose verlassen könnte. Diese Hypothese wurde an Hand von Ca2+- Ausstrommessungen an verschiedenen Hefestämmen untersucht. Anhand von Stämmen, die aufgrund einer sec- Mutation ein temperatursensitives Sekretionsverhalten aufweisen, konnte gezeigt werden, dass Ca2+ , verpackt in sekretorische Vesikel, entlang des Sekretionswegs zur Plasmamembran transportiert und bei der Fusion der post- Golgi Vesikel mit der Plasmamembran aus der Hefezelle freigesetzt wird. Der Ca2+- Ausstrom erfolgt also über Exocytose. In einem weiteren Projekt wurde der Aminosäuretransport durch die Aminosäurepermease Gap1 in delta- pmr1- Zellen untersucht. Kinetische Transportmessungen mit radioaktiv markierten Aminosäuren ergaben, dass die Transportaktivität von Gap1 in delta- pmr1- Zellen drastisch reduziert ist und dass vermutlich eine Form von unkompetitiver Inhibierung von Gap1 in delta- pmr1-Zellen vorliegt. In einem dritten Projekt wurde nach genetischen Interaktionspartnern von Pmr1 gesucht. Dabei wurde festgestellt, dass delta- pmr1 delta- bst1, delta- pmr1 delta- sac2, delta- pmr1 delta- vps24 Doppelmutanten auf YPD- Platten einen starken Wachstumsdefekt aufweisen.
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Kinetic analysis and simulation studies for lipase-catalysed resolution of racemic 2-methyl-1-pentanol
(1993) Indlekofer, Michael; Reuss, Michael; Barth, Stefan; Effenberger, Franz
The lipase-catalysed optical resolution of a racemic mixture of 2-methyl-1-pentanol by transesterification using vinyl acetate as acyl donor has been studied experimentally. A mechanistic model has been developed for the double-substrate reaction sequence treating both enantiomers as competing substrates. The model is based upon a ping-pong mechanism with alternative substrates involving an acyl-enzyme intermediate. The kinetic constants of the model have been evaluated using initial rate experiments and nonlinear regression analysis. The model successfully predicts the evolution of the enantiomeric excess of substrate (eeR) and the degree of conversion with time for batch experiments with various initial concentrations of vinyl acetate and (R,S)-2-methyl-1-pentanol. Furthermore, the rate equations have been used to theoretically study the dynamic progression of a continuous enzyme-catalysed resolution process. The enantiomeric excess as a function of conversion for different process configurations is discussed. It is found, that the maximum attainable eeR is strongly dependent on the residence time distribution of the continuous reactor and is rather low for a continuous stirred tank reactor (CSTR) due to competitive inhibition effects.
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Funktionsverlust der Ionenpumpe Pmr1 induziert programmierten Zelltod in Saccharomyces cerevisiae
(2007) Kraus, Saskia; Rudolph, Hans (PD Dr.)
In der Hefezelle Saccharomyces cerevisiae werden die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen durch Ca2+-Kanäle und ATPasen reguliert. Pmr1, die Ca2+-ATPase des Golgi-Apparates, bildet einen Eckpfeiler der Ca2+-Homöostase. So erfolgt nach einem raschen Anstieg der freien zytosolischen Ca2+-Konzentration, z.B. durch das Öffnen von Mid1/Cch1 Ca2+- Kanälen in der Plasmamembran ein aktives Entfernen von Ca2+ aus dem Zytosol. Pmr1 transportiert sowohl Ca2+ als auch Mn2+ aus dem Zytosol in den Golgi-Apparat. Künstlich erzeugte Funktionsstörungen dieser Transporter haben für eine Zelle weitreichende Konsequenzen. Eine pmr1-Mutation ist nicht letal, aber sie verursacht einen schnellen Verlust der Lebensfähigkeit in stationärer Phase. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Zellen typische Merkmale der Apoptose aufweisen. Der Apoptoseprozess ist morphologisch durch die Aufhebung der asymmetrischen Verteilung der Phospholipide der Plasmamembran, die Kondensation des Chromatins an der Kernhülle und die Zellfragmentierung in so genannte apoptotische Körper gekennzeichnet. Da Pmr1 für die korrekte Physiologie des Golgi-Apparates benötigt wird und somit eine zentrale Komponente der Sekretionsmaschine ist, wurde bei weiteren Sekretionsmutanten nach apoptosetypischen Merkmalen gesucht. Die meisten sec-Mutationen sind letal. Bei konditionellen ts sec-Mutanten konnte unter restriktiver Temperatur Chromatinkondensation durch Anfärben mit Diaminophenylindol, einem selektiven, blau fluoreszierenden und in DNA interkalierenden Farbstoff, gezeigt werden. Um die Degradation der DNA nachzuweisen wurde der TUNEL Test (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) angewandt. Der Zustand der Plasmamembran wurde mit Annexin V aufgezeigt. In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass eine Mutation in dem Ca2+-Transporter des Golgi-Apparates Pmr1 zu drastischen Veränderungen in der Zellwand führen. Eine starke Reduktion der totalen Zellwandmasse und eine Verschiebung der zuckerhaltigen Zellwandkomponenten Glukose, Mannose und N-Acetylglucosamin liegen vor. In pmr1-Mutanten ist auch die Konzentration der katalytischen Untereinheit der β-1,3 Glukansynthase, einem Schlüsselenzym der Zellwandsynthese, stark erhöht. Diese Änderung des pmr1-Expressionsmusters wurde mit Hilfe eines Fks2/LacZ-Reporters detektiert. Weiterführend wurde eine genetische Methode entwickelt, um in Verbindung mit pmr1 synthetisch letale Mutationskombinationen zu identifizieren. Als genetische Interaktionspartner von Pmr1 wurden dadurch die proteinglycosylierende Golgi-Apyrase Ynd1 und eine Komponente des Mannosylpolymerase1 Komplexes Van1 gefunden.
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Die Glucose-induzierte Katabolitinaktivierung der Fructose-1,6-bisphosphatase der Hefe Saccharomyces cerevisiae: neue Komponenten ihres Ubiquitin-Proteasom-katalysierten Abbaus
(2003) Josupeit, Frank Stephan; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
Wachsen Hefezellen auf nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen, wird Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) exprimiert. Nach externer Glucosegabe zu den Hefezellen wird das Schlüsselenzym der Gluconeogenese in einem Katabolitdegradation genannten Prozess schnell abgebaut. Der zelluläre Abbauort der FBPase wird kontrovers diskutiert. 2 verschiedene Abbauwege wurden beschrieben, von denen der eine von der vakuolären Proteolyse und der andere vom Ubiquitin-Proteasom-System abhängig ist. Gene, deren Deletionsmutantenstämme einen Defekt im glucoseinduzierten Abbau der FBPase aufweisen, werden GID- (glucose induced degradition deficient) Gene genannt. Mit den Genen GID4/VID24 und GID9/FYV10 wurden 2 neue Komponenten des proteasomalen FBPase-Abbauweges identifiziert. Zwei GID-Gene (GID4/VID24 und GID5/Vid28) wurden zuvor auch von der Gruppe um H.L. Chiang gefunden. Beide Gene sind auch am vakuolären Abbau der FBPase beteiligt. Deshalb wurde untersucht, ob noch mehr am vakuolären FBPase-Abbauweg beteiligte Gene auch am proteasomalen FBPase-Abbauweg beteiligt sind. Die drei untersuchten Gene VID22, VID27 und CPR1 zeigten allerdings keine Beteiligung am proteasomalen Abbau des Proteins. Hefezellen, die auf nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen wuchsen, exprimierten erst nach Glucosezugabe Vid24p. Das Protein wird innerhalb von ca. 120 min nach Glucosezugabe wieder abgebaut. Die Gene GID1, GID2, GID3, GID5, GID6, GID8 und GID9 sind für die Degradation von Vid24p essentiell. Vid24p ist ein mögliches proteasomales Substrat und übt seine Funktion im FBPase-Abbau erst nach der Ubiquitinierung der FBPase aus. Gid2p ist ein Teil eines mögliches Proteinkomplexes mit einer molekularen Masse von 600 kDa oder mehr. In Interaktionsstudien konnte eine Interaktion zwischen Gid2p und der FBPase gezeigt werden, für welche das aminoterminale Prolin der FBPase essentiell ist. Eine weiter Interaktion konnte zwischen Gid2p und dem Proteasom beobachtet werden.
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Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum: Variationen im Abbaumechanismus von löslicher und membrangebundener missgefalteter CarboxypeptidaseY (CPY*)
(2002) Taxis, Christof; Wolf, Dieter, H. (Prof. Dr.)
Geregelter Proteinabbau ist eine Möglichkeit für eukaryontische Zellen Stoffwechselwege und Enzymaktivität zu regulieren. Dies ermöglicht ihnen Wachstum, Differenzierung und metabolische Adaption. Der Abbau nicht funktioneller oder falsch gefalteter Proteine schützt die Zelle vor Proteinablagerungen, die Zellfunktionen entscheidend stören und zur Entwicklung von Krankheiten, wie Alzheimer oder Parkinson, führen können. Eine wichtige Aufgabe ist hierbei die Kontrolle der Proteine, in Bezug auf ihre intakte Struktur, die für das sekretorische System bestimmt sind und ihren Wirkungsort im endoplasmatischen Retikulum (ER), dem Golgi Apparat, der Vakuole oder an der Plasmamembran haben. Alle diese Proteine unterzieht die Zelle nach dem Transport ins ER einer Qualitätskontrolle; falsch gefaltete Proteine werden zurückgehalten und dem Abbau über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System zugeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von drei unterschiedlichen Substraten verglichen, die von der Qualitätskontrolle im ER erkannt und dem Abbau zugeführt werden. Alle drei Substrate besitzen den gleichen, falsch gefalteten Proteinteil im Lumen des ER, die punktmutierte Carboxypeptidase yscY (CPY*). Es wurde untersucht, ob Komponenten der Abbaumaschinerie variieren, wenn an CPY* eine Transmembrandomäne (CPY*-Transmembrandomäne, Abk.: CT*) oder noch zusätzlich zur Transmembrandomäne das grün fluoreszierende Protein (GFP) als zytosolische Domäne angefügt wird (CPY*-Transmembrandomäne-GFP, Abk.: CTG*). Es konnte gezeigt werden, dass CT* und CTG* Typ I Membranproteine sind, deren N-terminale, CPY* enthaltende Teile glykosyliert werden und sich im ER-Lumen befinden, wohingegen deren C-terminale Teile im Zytosol lokalisiert sind. Aus früheren Arbeiten waren einige der zum Abbau von CPY* notwendigen Proteine bekannt. Es wurde deshalb untersucht, ob sie auch bei der Degradation von CT* und CTG* eine Rolle spielen. Es wurde festgestellt, dass CT* und CTG*, wie CPY*, über das zytosolische Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut werden. Die Degradation beider Substrate ist in proteasomalen Mutanten verlangsamt. Ebenso sind zum Abbau die Ubiquitin übertragenden Proteine Ubc1p und Ubc7p zusammen mit der Ubiquitin-Ligase Der3/Hrd1p notwendig. Des Weiteren wurde gefunden, dass die AAA-ATPase Cdc48p benötigt wird. Dagegen wird Kar2p, ein Chaperon aus dem ER Lumen, nur für den Abbau von CPY* gebraucht, nicht jedoch für CT* und CTG*. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Ssa-Familie der zytosolischen Hsp70 Chaperone Einfluss auf den Abbau von CT* und CTG* ausübt. Es war bekannt, dass diese Chaperone nicht für den Abbau von löslichen Substraten benötigt werden. Es wurde gefunden, dass sie für die Degradation von CTG* essenziell sind, nicht jedoch für CT*. Die Chaperone sind vermutlich nötig, um die zytosolische GFP-Domäne in CTG* zu entfalten. Im Rahmen der Arbeiten zum Einfluss der AAA-ATPase Cdc48p auf den CPY* Abbau wurde festgestellt, dass eine Blockierung des Transportes vom ER zum Golgi einen Defekt im Abbau von CPY* zur Folge hat. Dies ist wahrscheinlich auf eine Reduzierung des ER oder die Misslokalisierung von Kar2p in diesen Transportmutanten zurückzuführen. Doppelmutanten, die Transportdefekte zwischen ER und Golgi aufweisen und gleichzeitig die Fähigkeit verloren haben, auf ungefaltete Proteine im ER zu reagieren, können CPY* praktisch überhaupt nicht mehr abbauen. Eine Haemagglutinin-Tag (HA) Version von CPY* wurde mit Hilfe von elektronenoptischen Aufnahmen in der Hefezelle lokalisiert. CPY* kann bei Blockade des Abbaus aus dem ER entkommen und findet sich dann im Golgi, der Vakuole und sezerniert im Medium. Diese Sekretion von CPY* konnte unabhängig hiervon auch biochemisch mit Hilfe von Immunodetektion bestätigt werden. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass die Vakuole zum Abbau von CPY* in Dder1 Zellen beiträgt. In Mutanten, die Defekte im Abbau von missgefalteten Proteinen aus dem ER aufweisen, wird die Morphologie des ER und Golgi verändert und der Transport von Wildtyp CPY durch das sekretorische System verlangsamt.
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Apoptosis in the yeast saccharomyces cerevisiae : a novel cell death process regulated by the ubiquitin-proteasome system
(2001) Ligr, Martin; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
Apoptosis is co-regulated by the conserved family of Bcl-2-related proteins, which includes both its agonists (Bax) and antagonists (Bcl-XL). A mutant strain of the yeast Saccharomyces cerevisiae has been shown to express all morphological signs of apoptosis. Overexpression of Bax is lethal in S. cerevisiae, whereas simultaneous overexpression of Bcl-XL rescues the cells. We report that overexpression of mammalian Bax in a S. cerevisiae wild type strain triggers morphological changes similar to those of apoptotic metazoan cells: the loss of asymmetric distribution of plasma membrane phosphatidylserine, plasma membrane blebbing, chromatin condensation and margination, and DNA fragmentation. Simultaneous overexpression of Bcl-XL prevents these changes. We demonstrate that Bax triggers phenotypic alterations in yeast strongly resembling those it causes in metazoan apoptotic cells. Oxygen radicals are important components of metazoan apoptosis. Oxygen radicals accumulate in yeast cells overexpressing Bax, whereas radical depletion or hypoxia prevents apoptosis. This suggests that the generation of oxygen radicals is a key event in the ancestral apoptotic pathway and offer an explanation for the mechanism of Bax-induced apoptosis in the absence of any established apoptotic gene in yeast. I have identified the yeast gene STM1 in an overexpression screen for new proteasomal substrates. Stm1 is a bona fide substrate of the proteasome. It is localized in the perinuclear region and is required for growth in the presence of mutagens. Overexpression in cells with impaired proteasomal degradation leads to cell death accompanied with cytological markers of apoptosis. Cells lacking Stm1 display deficiency in the apoptosis-like cell death process induced by treatment with low concentrations of H2O2. I suggest that Stm1 is involved in the control of the apoptosis-like cell death in yeast.
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Katabolitinaktivierung der Fructose-1,6-bisphosphatase: Identifizierung und Charakterisierung neuer, für ihren Ubiquitin-Proteasom-katalysierten Abbau benötigter Proteine
(2005) Regelmann, Jochen; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
Die Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) wird synthetisiert, wenn Saccharomyces cerevisiae-Zellen auf einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle (z. B. Ethanol oder Glycerin) wachsen. Nach Glucosegabe wird die Neusynthese abgeschaltet und das Enzym in zwei Schritten inaktiviert. Der Inaktivierungsprozeß beeinhaltet: 1) die Phosphorylierung des Enzyms und 2) den Abbau des Proteins mit einer Halbwertszeit von 20-30 Minuten. Dieser Vorgang wird als Katabolitinaktivierung bezeichnet und ist einer der zentralen Schritte beim Umschaltprozeß der Zelle von der Gluconeogenese zur Glykolyse. Um den molekularen FBPase-Inaktivierungsmechanismus besser verstehen zu können, wurde im Rahmen dieser Dissertation nach sogenannten Gid-Proteinen gesucht und diese im Folgenden einer detaillierten Analyse unterzogen.

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