Universität Stuttgart
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Item Open Access Modellgestützte Entwicklung eines Prozesses für die mikrobielle Hydrolyse von Propionitril zu Ammoniumpropionat(2000) Christian, Hans Jürgen; Syldatk, Christoph (Prof. Dr. rer. nat.)Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand in der Entwicklung der Grundlagen für einen Prozeß zur mikrobiellen Hydrolyse von Propionitril zu Ammoniumpropionat. Zu Beginn der Arbeit wurde der verwendete Mikroorganismus auf seine Gattungszugehörigkeit hin untersucht und als Patentstamm Rhodococcus erythropolis DSM 13002 bei der DSMZ hinterlegt. Zur Bereitstellung einer geeigneten Menge an homogener Biomasse wurde der Stamm in einem Maßstab von 70 l im Bioreaktor kultiviert. In weiteren Untersuchungen erfolgte dann eine Optimierung des Wachstumsmediums. Die Untersuchung der nitrilverseifenden Eigenschaften ergab, daß in dem untersuchten Stamm ein Zwei-Enzym-System aus einer eisenabhängigen Nitrilhydratase und einer Amidase vorlag. Diese wurden auf ihre biochemischen Eigenschaften im Ganzzellsystem hin untersucht. Durch Immobilisierung der Zellen konnte die Toleranz des Biokatalysators gegenüber dem Substrat Propionitril deutlich verbessert und bei einer absatzweisen Prozeßführung Nitrilkonzentrationen bis über 1 M umgesetzt werden. Bei der Untersuchung des Einflusses der Immobilisierung auf die Aktivität wurde eine moderate innere und äußere Stofftransportlimitierung bestimmt. Der Biokatalysator wurde als Immobilisat in absatzweiser Prozeßführung mit konstanter Substratzugabe (Fed-batch), im kontinuierlichen Rührreaktor sowie im Festbett eingesetzt. Dabei konnten im Fed-batch Prozeß Produktkonzentrationen von bis zu 3 M Ammoniumpropionat erhalten werden. In dieser Arbeit wurde ein Reaktionsmodell für das Zwei-Enzym-System erstellt. Anschließend wurden sämtliche Modellparameter über Anfangsreaktionsraten und mittels dynamischer Simulation in Verbindung mit nichtlinearer Regression bestimmt. Eine Anwendbarkeit der reaktionskinetischen Ansätze unter dynamischen Bedingungen wurde anhand eines Fed-batch-Prozesses überprüft und eine gute Übereinstimmung der simulierten Konzentrationsverläufe mit den Meßdaten ermittelt.Item Open Access Optimizing mass transfer in multiphase fermentation : the role of drag models and physical conditions(2023) Mast, Yannic; Wild, Moritz; Takors, RalfDetailed knowledge of the flow characteristics, bubble movement, and mass transfer is a prerequisite for the proper design of multiphase bioreactors. Often, mechanistic spatiotemporal models and computational fluid dynamics, which intrinsically require computationally demanding analysis of local interfacial forces, are applied. Typically, such approaches use volumetric mass-transfer coefficient (kLa) models, which have demonstrated their predictive power in water systems. However, are the related results transferrable to multiphase fermentations with different physicochemical properties? This is crucial for the proper design of biotechnological processes. Accordingly, this study investigated a given set of mass transfer data to characterize the fermentation conditions. To prevent time-consuming simulations, computational efforts were reduced using a force balance stationary 0-dimension model. Therefore, a competing set of drag models covering different mechanistic assumptions could be evaluated. The simplified approach of disregarding fluid movement provided reliable results and outlined the need to identify the liquid diffusion coefficients in fermentation media. To predict the rising bubble velocities uB, the models considering the Morton number (Mo) showed superiority. The mass transfer coefficient kL was best described using the well-known Higbie approach. Taken together, the gas hold-up, specific surface area, and integral mass transfer could be accurately predicted.Item Open Access CFD-Simulationen von Mischvorgaengen und biotechnischen Stoffumsetzungen in begasten Rührkesselreaktoren(2001) Schmalzriedt, Sven; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)Rührkesselreaktoren kommen in zahlreichen chemischen und biotechnischen Produktionsprozessen zur Anwendung, für biotechnische Stoffumwandlungen sind sie sogar der wichtigste Standardapparat. Die Methoden der numerischen Strömungssimulation (Computational Fluid Dynamics, CFD) liefern heute die Grundlage für detaillierte Untersuchungen der lokalen und zeitabhängigen Vorgänge bei Stoffumsetzungen in der turbulenten Zweiphasenströmung im Rührkesselreaktor. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zum Einsatz von CFD-Simulationen bei der Analyse und Vorausberechnung biotechnischer Stoffumsetzungen in Rührkesselreaktoren entwickelt und auf exemplarische biotechnische Stoffumsetzungen angewendet. Bei der Modellierung wurde ein Mittelweg zwischen Komplexität und praktischer Anwendbarkeit gewählt, der auf der Entkopplung der Simulation von Fluiddynamik und Stoffumsetzungen beruht. Dadurch wurde die dynamische Simulation der Stoffbilanzen auf stationären Strömungsfeldern ermöglicht. Zunächst wurde das Durchmischungsverhalten in verschiedenen Reaktorkonfigurationen mit Einfach- und Mehrfachrührern anhand der Simulation von Pulsexperimenten untersucht. Simulationen der während der aeroben Fermentation von Saccharomyces cerevisiae auftretenden Substratverteilungen zeigen exemplarisch den erheblichen Einfluss der Konzentrationsgradienten auf das Ergebnis von im Zulaufverfahren durchgeführten Bioprozessen. Als Einflussfaktoren wurden die Rührerkombination im Mehrfachrührersystem sowie Rührerdrehzahl und Belüftungsrate betrachtet, wobei insbesondere die Wahl einer geeigneten Rührerkombination entscheidend ist. Es wird gezeigt, wie die unerwünschte Nebenproduktbildung durch die Berechnung eines optimalen Zulaufortes des Substrats minimiert werden kann. Zusätzlich wurden auf der Basis zweiphasiger, mit einem algebraic-slip-Ansatz berechneter Strömungsfelder die zugehörigen Verteilungen der Gelöstsauerstoffkonzentration simuliert.Item Open Access Mimicking CHO large‐scale effects in the single multicompartment bioreactor : a new approach to access scale‐up behavior(2024) Gaugler, Lena; Hofmann, Sebastian; Schlüter, Michael; Takors, RalfDuring the scale‐up of biopharmaceutical production processes, insufficiently predictable performance losses may occur alongside gradients and heterogeneities. To overcome such performance losses, tools are required to explain, predict, and ultimately prohibit inconsistencies between laboratory and commercial scale. In this work, we performed CHO fed‐batch cultivations in the single multicompartment bioreactor (SMCB), a new scale‐down reactor system that offers new access to study large‐scale heterogeneities in mammalian cell cultures. At volumetric power inputs of 20.4-1.5 W m-3, large‐scale characteristics like long mixing times and dissolved oxygen (DO) heterogeneities were mimicked in the SMCB. Compared to a reference bioreactor (REFB) set‐up, the conditions in the SMCB provoked an increase in lactate accumulation of up to 87%, an increased glucose uptake, and reduced viable cell concentrations in the stationary phase. All are characteristic for large‐scale performance. The unique possibility to distinguish between the effects of changing power inputs and observed heterogeneities provided new insights into the potential reasons for altered product quality attributes. Apparently, the degree of galactosylation in the evaluated glycan patterns changed primarily due to the different power inputs rather than the provoked heterogeneities. The SMCB system could serve as a potent tool to provide new insights into scale‐up behavior and to predict cell line‐specific drawbacks at an early stage of process development.Item Open Access Compartment‐specific 13C metabolic flux analysis reveals boosted NADPH availability coinciding with increased cell‐specific productivity for IgG1 producing CHO cells after MTA treatment(2021) Wijaya, Andy Wiranata; Verhagen, Natascha; Teleki, Attila; Takors, RalfIncreasing cell‐specific productivities (CSPs) for the production of heterologous proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells is an omnipresent need in the biopharmaceutical industry. The novel additive 5′‐deoxy‐5′‐(methylthio)adenosine (MTA), a chemical degradation product of S‐(5′‐adenosyl)‐ʟ‐methionine (SAM) and intermediate of polyamine biosynthesis, boosts the CSP of IgG1‐producing CHO cells by 50%. Compartment‐specific 13C flux analysis revealed a fundamental reprogramming of the central metabolism after MTA addition accompanied by cell‐cycle arrest and increased cell volumes. Carbon fluxes into the pentose‐phosphate pathway increased 22 fold in MTA‐treated cells compared to that in non‐MTA‐treated reference cells. Most likely, cytosolic ATP inhibition of phosphofructokinase mediated the carbon detour. Mitochondrial shuttle activity of the α‐ketoglurarate/malate antiporter (OGC) reversed, reducing cytosolic malate transport. In summary, NADPH supply in MTA‐treated cells improved three fold compared to that in non‐MTA‐treated cells, which can be regarded as a major factor for explaining the boosted CSPs.Item Open Access Stability of a mutualistic Escherichia coli co‐culture during violacein production depends on the kind of carbon source(2024) Schick, Simon; Müller, Tobias; Takors, Ralf; Sprenger, Georg A.The L‐tryptophan-derived purple pigment violacein (VIO) is produced in recombinant bacteria and studied for its versatile applications. Microbial synthetic co‐cultures are gaining more importance as efficient factories for synthesizing high‐value compounds. In this work, a mutualistic and cross‐feeding Escherichia coli co‐culture is metabolically engineered to produce VIO. The strains are genetically modified by auxotrophies in the tryptophan (TRP) pathway to enable a metabolic division of labor. Therein, one strain produces anthranilate (ANT) and the other transforms it into TRP and further to VIO. Population dynamics and stability depend on the choice of carbon source, impacting the presence and thus exchange of metabolites as well as overall VIO productivity. Four carbon sources (D‐glucose, glycerol, D‐galactose, and D‐xylose) were compared. D‐Xylose led to co‐cultures which showed stable growth and VIO production, ANT‐TRP exchange, and enhanced VIO production. Best titers were ∼126 mg L -1 in shake flasks. The study demonstrates the importance and advantages of a mutualistic approach in VIO synthesis and highlights the carbon source's role in co‐culture stability and productivity. Transferring this knowledge into an up‐scaled bioreactor system has great potential in improving the overall VIO production.Item Open Access Getting the right clones in an automated manner : an alternative to sophisticated colony-picking robotics(2024) Hägele, Lorena; Pfleger, Brian F.; Takors, RalfIn recent years, the design-build-test-learn (DBTL) cycle has become a key concept in strain engineering. Modern biofoundries enable automated DBTL cycling using robotic devices. However, both highly automated facilities and semi-automated facilities encounter bottlenecks in clone selection and screening. While fully automated biofoundries can take advantage of expensive commercially available colony pickers, semi-automated facilities have to fall back on affordable alternatives. Therefore, our clone selection method is particularly well-suited for academic settings, requiring only the basic infrastructure of a biofoundry. The automated liquid clone selection (ALCS) method represents a straightforward approach for clone selection. Similar to sophisticated colony-picking robots, the ALCS approach aims to achieve high selectivity. Investigating the time analogue of five generations, the model-based set-up reached a selectivity of 98 ± 0.2% for correctly transformed cells. Moreover, the method is robust to variations in cell numbers at the start of ALCS. Beside Escherichia coli , promising chassis organisms, such as Pseudomonas putida and Corynebacterium glutamicum , were successfully applied. In all cases, ALCS enables the immediate use of the selected strains in follow-up applications. In essence, our ALCS approach provides a ‘low-tech’ method to be implemented in biofoundry settings without requiring additional devices.Item Open Access Immobilisierung und Stabilisierung der Hydantoinase und L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens DSM 3747(2000) Ragnitz, Kerstin; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)Hydantoinase-Verfahren gewinnen zunehmend an Bedeutung für die Herstellung enantiomerenreiner Aminosäuren. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedlichste adsorptive und kovalente Methoden zur Immobilisierung einer Hydantoinase und L-N-Carbamoylase untersucht. Die Wildtypenzyme aus Arthrobacter aurescens wurden durch Zellaufschluß und Ammoniumsulfat-Fällung angereichert und nach Resuspendierung im geeigneten Puffersystem direkt immobilisiert. Allerdings konnten damit sowohl für die Hydantoinase als auch für die L-N-Carbamoylase nur geringe Aktivitäten erzielt werden, die zu gering waren, um industriellen Anforderungen gerecht zu werden. Mit der Bereitstellung der rekombinanten Enzyme war es möglich diese getrennt voneinander aufzureinigen, um den Einfluß unterschiedlicher Immobilisierungsparameter wie Protein-Träger-Verhältnis, Kopplungsmethode und Art des Trägermaterials systematisch zu untersuchen. Die Immobilisierung der L-N-Carbamoylase war nur über die Carboxylgruppen des Enzyms möglich, während die Oxiran-Methode zu einer Inaktivierung des Enzyms führte. Unter Verwendung eines hydrophilen Trägermaterials konnten Aktivitätsausbeuten von 100% und spezifische Aktivitäten bis zu 11 U/g Träger erzielt werden. Die rekombinante Hydantoinase ließ sich relativ problemlos mit spezifischen Aktivitäten von 3 U/g Träger sowohl an Epoxid- als auch an primäre Aminogruppen koppeln. Durch Lagerung in manganhaltigem Puffer war darüberhinaus eine Hyperaktivierung des Immobilisates um das 5-fache möglich. Alternativ zur kovalenten Kopplung der Enzyme wurde die Metallaffinitätschromatographie für die spezifische Bindung rekombinanter His6-tag Proteine direkt aus dem Rohextrakt untersucht. Die Ermittlung der Prozeßstabilität ergab Halbwertszeiten von 14000 h (Hydantoinase) bzw. 1000 h (L-N-Carbamoylase). Die pH- und Temperaturoptima waren für die immobilisierte Hydantoinase und L-N-Carbamoylase vergleichbar, so daß ein Einsatz unter denselben Reaktionsbedingungen möglich ist.Item Open Access Klonierung der D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117(2001) Werner, Markus; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)Enantiomerenreiche D-Aminosäuren werden als Vorstufen für die industrierelevante Antibiotikaproduktion verwendet. Die Enzyme, die diese Reaktionen katalysieren werden als D-Hydantoinase und L-Carbamoylase bezeichnet. Ziel der Arbeit war es die molekularbiologischen Rahmenbedingungen zur Produktion der D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20017 zu etablieren. Die Klonierung der in der Literatur als instabil beschriebenen D-Carbamoylase sollte über die Klonierung der D-Hydantoinase erfolgen, die in der direkten Nachbarschaft der D-Carbamoylase vermutet wurde. Nach einer Fermentation wurde die D-Hydantoinase aufgereinigt und aus einem SDS-Gel eluiert. Nach einem tryptischen Verdau und der Auftrennung des Peptidgemisches über präparative HPLC wurden die sequenzierten Peptide zur Ableitung von Primern für eine degenerierte PCR verwendet. Dies führte zur Klonierung des ersten DNA-Abschnittes des D-Hydantoinasegens. Mit Hilfe der inversen PCR wurde weitere Bereiche des hyu-Operons sequenziert: die kompletten Leserahmen einer D-Hydantoinase, D- und L-Carbamolyase sowie die Teilsequenzen einer Permease und eines poteniellen Regulatorproteins. Die D-Carbamoylase wurde bezüglich des Substratspektrums, des Molekulargewichtes, pH- und Temperaturoptimums und der Metallabhängigkeit charakterisiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der katalytische Reaktionsmechanismus von bestimmten D- und L-Carbamoylase aufgeklärt. Hierzu wurden qualitative Assays für die Umsetzung verschiedener D,L-Carbamoyl-Phenylalanin-Derivaten etabliert, die an unterschiedlichen Positionen des Moleküls durch andere Atome oder Atomgruppen substituiert waren. Die Ergebnisse zeigen, dass D-Carbamoylasen die Decarbamoylierung durch einen Amidasemechanismus katalysieren, während L-Carbamoylasen eine 'echte' Decarbamoylierung des Substrates bewirken. Basierend auf den unterschiedlichen Umsetzungsdaten konnten für beide Katalysetypen die zugrundeliegenden Reaktionsmechanismen beschrieben werde.Item Open Access Mikrobieller Befall von Elektrotauchlack in der Automobilindustrie(2000) Gühring, Ina Katrin; Syldatk, Christoph (Prof. Dr.)Nach Umstellung auf umweltverträglichere Lackmaterialien (Reduzierung biozid wirkender Lösemittel, Schwermetalle) traten in Elektrotauchanlagen verschieder Werke der DaimlerChrysler AG vermehrt Beschichtungsstörungen bei Karossen auf. Dabei war ein pH-Anstieg des Lackmaterials, Schichtdickenanstieg, Abblättern des Lacks („Striptease“ Effekt), Oberflächenstörungen (Pusteln, Blasen, Krater), schlechter Umgriff, eine Bildung von Lackschlamm und geringerer Schichtwiderstand zu beobachten. Gleichzeitig wurden Mikroorganismen im Lackbad nachgewiesen. Dies führte unter erheblichem Kostenaufwand teilweise zur Notwendigkeit, die Becken völlig neu mit Elektrotauchlack zu befüllen und das alte Material als Sondermüll zu entsorgen. Es war nicht geklärt, ob die Störungen durch mikrobiologische oder chemische Faktoren hervorgerufen wurden. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Ursachen der aufgetretenen Schäden, sowie die Faktoren, die zur Verkeimbarkeit des Elektrotauchlacks führen, zu ermitteln. Darüber hinaus wurde die KTL-Anlage 34-II in Sindelfingen routinemäßig mikrobiologisch untersucht, im Schadensfall auch Anlagen anderer Werke der DaimlerChrysler AG. Die isolierten Mikroorganismen wurden identifiziert und ihr Einfluß auf den Beschichtungsprozess überprüft. Es konnte erstmals eindeutig gezeigt werden, daß die entstandenen Schäden durch mikrobielles Wachstum in KT-Lack hervorgerufen wurden und nicht durch chemische Faktoren bedingt waren. Dabei trägt die Alterung und die Ultrafiltration des Lacks, sowie das Absinken des Lösungsmittelgehalts entscheidend zur Verkeimbarkeit des Materials bei. Aus dem Elektrotauchlack konnte bisher hauptsächlich Burkholderia cepacia isoliert werden. Mit diesem Keim wurden Wachstums- und Hemmversuche mit verschiedenen organischen Säuren und Lacklösungsmitteln durchgeführt. Auf diese Weise wurde ermittelt, welche Substanzen von B. cepacia als C-Quelle genutzt werden können, bzw. welche toxisch auf die Mikroorganismen wirken.