Universität Stuttgart
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Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Impact of remote mutations on metallo-beta-lactamase substrate specificity : implications for the evolution of antibiotic resistance(2005) Ölschläger, Peter; Mayo, Stephen L.; Pleiss, JürgenMetallo-beta-lactamases have raised concerns due to their ability to hydrolyze a broad spectrum of beta-lactam antibiotics. The G262S point mutation distinguishing the metallo-beta-lactamase IMP 1 from IMP 6 has no effect on the hydrolysis of the drugs cephalothin and cefotaxime, but significantly improves catalytic efficiency toward cephaloridine, ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem. This change in specificity occurs even though residue 262 is remote from the active site. We investigated the substrate specificities of five other point mutants resulting from single nucleotide substitutions at positions near residue 262: G262A, G262V, S121G, F218Y and F218I. The results suggest two types of substrates: type I (nitrocefin, cephalothin and cefotaxime), which are converted equally well by IMP-6, IMP-1, and G262A, but even more efficiently by the other mutants, and type II (ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem), which are hydrolyzed much less efficiently by all the mutants, with IMP-1 being the most active. G262V, S121G, F218Y, and F218I improve conversion of type I substrates, whereas G262A and IMP-1 improve conversion of type II substrates, indicating two distinct evolutionary adaptations from IMP-6. Substrate structure may explain the catalytic efficiencies observed. Type I substrates have R2 electron donors, which may stabilize the substrate intermediate in the binding pocket and lead to enhanced activity. In contrast, the absence of these stabilizing interactions with type II substrates may result in poor conversion and increased sensitivity to mutations. This observation may assist future drug design. As the G262A and F218Y mutants confer effective resistance to Escherichia coli BL21(DE3) cells (high minimal inhibitory concentrations), they are likely to evolve naturally.Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.Item Open Access Enzymatische und chemische Studien zur Veresterung und Löslichkeit von Cellulose in ionischen Flüssigkeiten(2017) Hinner, Lars Pieter; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Cellulose ist der Hauptbestandteil der pflanzlichen Zellwand und daher die häufigste organische Verbindung auf unserem Planeten. Dieses nachwachsende Biopolymer wird heutzutage hauptsächlich für die Produktion von Papier und Zellstoff verwendet oder verbrannt und somit als billiger Energieträger genutzt. Viele alternative Anwendungsgebiete sind aufgrund von unzureichenden Materialeigenschaften schwierig zu realisieren. Insbesondere thermoplastische Anwendungen sind nicht durchführbar, da Cellulose keinen Schmelzpunkt besitzt. Auch die chemische Modifikation der Cellulose - mit dem Ziel, andere Materialeigenschaften zu generieren - ist schwierig, da Cellulose nicht in Wasser oder in üblichen organischen Lösungsmitteln gelöst werden kann. Bis dato wurden daher industriell heterogene Synthesen entwickelt, um Cellulose im nicht gelösten Zustand zu modifizieren. Hierbei sind allerdings aufwendige mechanische und chemische Vorbehandlungen notwendig, um eine effiziente Verarbeitung bzw. Modifizierung der Cellulose zu gewährleisten. Zusätzlich sind heterogene Synthesen zur Produktion von Celluloseestern, aufgrund der starken sterischen Hinderung der nicht gelösten Cellulose, auf kurzkettige Acyldonoren (C2-C4) beschränkt. Somit ist es mit heterogenen Prozessen nicht möglich, das komplette Spektrum an potenziellen Celluloseestern zu erzeugen. Es gibt allerdings ein steigendes Interesse an neuartigen Celluloseestern, da beispielsweise Celluloseacetat nur eine schlechte thermoplastische Prozessierbarkeit aufweist. Die Herstellung von neuartigen Celluloseestern kann in homogenen Synthesen besser realisiert werden, in denen Cellulose vollständig gelöst vorliegt. Als Reaktionsmedium können unter anderem spezielle ionische Flüssigkeiten genutzt werden, welche in der Lage sind, Cellulose zu lösen. In diesem Kontext wurden verschiedene Synthesen entwickelt, welche reaktive Acyldonoren verwenden. Der Einsatz von derartigen Acyldonoren, wie beispielsweise Carbonsäurechloriden ist allerdings problematisch, da diese sowohl das Cellulosegrundgerüst, als auch die ionische Flüssigkeit zersetzen können. Daher erscheint eine homogene enzymatische Synthese von Celluloseestern als interessante Alternative, da durch die Verwendung von enzymatischen Katalysatoren weniger reaktive Acyldonoren, wie beispielsweise Ester, genutzt werden können. Angesichts der Herausforderung, unter moderaten Bedingungen zu katalysieren, lag ein Fokus der hier vorgelegten Arbeit in der Entwicklung einer enzymatischen Synthese von Celluloseestern mit langen Seitenketten. Da die Analytik von niedrig substituierten Celluloseestern schwierig ist, wurden zunächst leichter zu analysierende Modellreaktionen untersucht. Einfache Veresterungs- und Umesterungsreaktionen können in Cellulose-lösenden ionischen Flüssigkeiten erfolgreich enzymatisch katalysiert werden. Die enzymatische Synthese von Glucoseestern war jedoch nur in ionischen Flüssigkeiten erfolgreich, welche Cellulose nicht lösen. Als möglicher Grund hierfür wird eine mangelnde Interaktion zwischen Enzym und Glucose in diesen polaren ionischen Flüssigkeiten postuliert. Um die Interaktion zwischen Enzym und Glucose zu steigern, wurde die Glucosekonzentration erhöht, was allerdings zu keiner erfolgreichen Synthese von Glucoselaurat führte, da die große Viskosität von hoch konzentrierten Zuckerlösungen den Massentransfer und damit die Reaktion zusätzlich inhibiert. Eine Steigerung der Interaktionswahrscheinlichkeit zwischen Enzym und Glucose durch die Erhöhung der Glucosekonzentration ist allerdings in dem ebenfalls polaren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) erfolgreich und erzeugt ab einer Glucosekonzentration von 60 % w/v signifikante Mengen an Glucoselaurat. Um sich in einem nächsten Schritt an den polymeren Charakter der Cellulose weiter anzunähern, wurde die enzymatische Veresterung des Dimers der Cellulose, d.h. der Cellobiose, als weitere Modellreaktion untersucht. Hierbei katalysiert das Enzym Candida antarctica Lipase B (CAL-B) die Synthese von nur sehr geringen Mengen an Cellobioseestern, wobei andere, ebenfalls aus Glucose aufgebaute Disaccharide wie Maltose und Trehalose, deutlich besser umgesetzt werden. Neunzehn verschiedene Enzympräparationen wurden auf die Fähigkeit untersucht, Cellobioselaurat zu synthetisieren. Den höchsten Umsatz katalysiert die Schweineleberesterase (PLE), jedoch zeigte dieses Enzym keine Aktivität gegenüber Cellulose als Ausgangssubstrat. Neben der enzymatischen Katalyse wurde eine chemische Synthese, basierend auf Vinylestern, entwickelt. Diese Vinylester-basierte Synthese ermöglicht erstmals die Acylierung von Cellulose mit Vinylestern in der biologisch abbaubaren ionischen Flüssigkeit 1-Ethyl-3-methylimidazoliumacetat ([EMIM]OAc). Die Reaktion läuft in Abwesenheit von zusätzlichen Katalysatoren ab und erlaubt die Synthese von Glucoseestern und Celluloseestern mit unterschiedlich langen Seitenketten. Es war möglich, Celluloseester mit Substitutionsgraden von 0,24 bis 3,00 zu erzeugen. Um die Reaktion zu charakterisieren, wurden verschiedene Reaktionsparameter wie Reaktionszeit, Temperatur und die Menge an Acyldonor systematisch variiert und mittels 1H-NMR, FT-IR und HPLC-GPC analysiert. Der höchste Veresterungsgrad ergibt sich bei einer Synthese-temperatur von 80°C und einer Reaktionszeit von zwei Stunden. Um die Synthese mit anderen Reaktionen aus der Literatur zu vergleichen, wurde eine Fettsäurechlorid-basierte Synthese von Barthel und Heinze in der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3-methylimidazoliumchlorid ([BMIM]Cl) reproduziert. Beide Reaktionen zeigen vergleichbare Substitutionsgrade (DS), jedoch ist der Polymerisationsgrad (DP) von Celluloselaurat nach der Fettsäurechlorid-basierten Synthese erheblich reduziert, während die Vinylester-basierte Synthese deutlich schonender ist und die Produktion von signifikant größeren Celluloseestern erlaubt. Bei der Vinylester-basierten Synthese in [EMIM]OAc wurde eine zusätzliche Acetylierung der Cellulose als unerwünschte Nebenreaktion identifiziert. Der Acetylierungsgrad steigt mit abnehmender Polarität und steigender sterischer Hinderung der eingesetzten Vinylester. Allgemein ist der Acetylierungsgrad nach der Vinylester-basierten Synthese in [EMIM]OAc allerdings deutlich niedriger als bei bereits beschriebenen Synthesen in [EMIM]OAc, welche Anhydride oder Fettsäurechloride als Acyldonoren nutzen. Das Produktspektrum der Vinylester-basierten Synthese konnte durch Verwendung zusätzlicher Acyldonoren wie Benzoesäurevinylester, Pivalinsäurevinylester, Neodecansäurevinylester und 2-Ethylhexansäurevinylester erfolgreich erweitert werden. Des Weiteren wurden die thermoplastischen und rheologischen Eigenschaften der Celluloseester im Rahmen einer Kooperation mit Linda Göbel vom Institut für Kunststofftechnik untersucht, wobei die thermoplastische Verarbeitbarkeit prinzipiell bestätigt wer-den konnte. Es wurde außerdem ein Upscaling der Synthese mit anschließendem Recycling der ionischen Flüssigkeit durchgeführt. Das Upscaling wurde in einem Laborreaktor mit 2,5 kg ionischer Flüssigkeit durchgeführt, wobei 233,25 g Celluloselaurat mit einem Substitutionsgrad von 2,3 synthetisiert werden konnte. Die ionische Flüssigkeit wurde mit einer durchschnittlichen Effizienz von 91 % w/w recycelt und konnte in einer nach-folgenden Synthese als Lösungsmittel eingesetzt werden. Insgesamt wurden drei Synthese-Recyclingzyklen durchgeführt, wobei der Substitutionsgrad nach den ersten zwei Synthesen bei 2,3 lag, bei der dritten bzw. vierten Synthese allerdings auf 1,8 bzw. 1,4 sank. Parallel zur Verringerung des Substitutionsgrades verkürzte sich die Lösezeit von Cellulose in der ionischen Flüssigkeit mit jedem weiteren Recyclingzyklus signifikant. Als Grund für die verbesserte Löslichkeit wurde die Bildung von 1-Ethyl-2-hydroxyethyl-3-methylimidazolium (EHEMIM) identifiziert, das durch die Reaktion einer Carben-Spezies des 1-Ethyl-3-methylimidazoliums (EMIM) mit Acetaldehyd - welches als Nebenprodukt bei der Vinylester-basierten Synthese auftritt - entsteht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Wasser für das verbesserte Lösungsvermögen des [EHEMIM]-[EMIM]OAc-Systems essentiell ist. Die besten Lösungseigenschaften wurden bei einem Kationenanteil von 50 mol-% EHEMIM bzw. 50 mol-% EMIM und einem Wassergehalt von 8,5 % w/w beobachtet. Dieses optimierte [EHE-MIM]-[EMIM]OAc-Wasser-System ermöglicht das Lösen von 14 % w/w Cellulose bei 80°C innerhalb von 3 Stunden. Im Gegensatz dazu löst die ursprüngliche ionische Flüssigkeit [EMIM]OAc bzw. [EMIM]OAc mit einem optimalen Wassergehalt von 10 % w/w unter den gleichen Bedingungen lediglich 1 % w/w bzw. 2 % w/w Cellulose.Item Open Access Zur Anwendbarkeit von Squalen-Hopen-Zyklasen als chirale Brønsted-Säuren in der asymmetrischen Katalyse(2014) Hammer, Stephan C.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Anwendung von Enzymen und Mikroorganismen als Katalysatoren in der organischen Synthese hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten als eine ernsthafte Ergänzung zur rein chemischen Katalyse etabliert. Jedoch ist die Bandbreite an biokatalytisch durchführbaren Reaktionen sehr gering. Für eine Vielzahl an synthetisch wertvollen Reaktionen wurden entsprechende Enzyme von der Natur nicht evolviert oder bisher nicht entdeckt. Die Entwicklung solcher Enzyme für die Katalyse nicht-physiologischer chemischer Transformationen ist ein zum größten Teil unerforschtes Arbeitsgebiet. Ein Ansatzpunkt ist die Nutzbarmachung bereits vorhandener enzymatischer Katalysezentren. Dies ist auch von besonders großer Bedeutung, da viele der in der organischen Chemie divers eingesetzten Aktivierungsmodi Bestandteil des enzymatischen Repertoires sind. Jedoch werden diese hoch-entwickelten enzymatischen Katalysezentren von der Natur häufig nur sehr spezialisiert eingesetzt und im Labor nur selten gezielt für nicht-natürliche Reaktionen entwickelt. In diesem Grenzgebiet, zwischen der organischen Synthesechemie und dem Enzymdesign, befindet sich der Fokus der hier vorliegenden Arbeit. Ziel war die Entwicklung einer Plattform für die enzymatische Brønsted-Säure-Katalyse. Dies ermöglicht einen potentiellen biokatalytischen Zugang zu einer Vielzahl an nicht-physiologischen, jedoch synthetisch wertvollen chemischen Transformationen, da die chirale Brønsted-Säure-Katalyse in der organischen Chemie zur Durchführung einer Vielzahl an wichtigen C-C-bindungsknüpfenden Reaktionen verwendet wird. Dieser Ansatz verbindet die leistungsstarke Brønsted-Säure-Katalyse mit den Vorteilen der Biokatalyse, namentlich den oft exzellenten Selektivitäten zusammen mit hohen Aktivitäten basierend auf einer Synthese in Wasser als „grüneres“ Lösungsmittel. Biokatalysatoren sind genetisch kodiert und lassen sich somit mikrobiell synthetisieren und einfach durch genetische Manipulation optimieren. Während die allgemeine Brønsted-Säure-Katalyse bei Enzymen eine wichtige Rolle spielt (z. B. bei der Stabilisierung von Übergangszuständen durch Bildung von Wasserstoffbrücken-bindungen) ist die enzymatische, spezifische Brønsted-Säure-Katalyse nicht beschrieben. Eine Ausnahme bilden hier die Squalen-Hopen-Zyklasen (SHCs), welche die kationische Polyzyklisierung von Squalen zu den pentazyklischen Produkten Hopen und Hopanol katalysieren. Zur Protonierung der terminalen C=C-Bindung des Substrates nutzen SHCs eine Asparaginsäure mit biologisch ungewöhnlich hoher Acidität. Während dieser Doktorarbeit wurde das katalytische Potential dieser einzigartigen Protonierungsmaschinerie studiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das natürliche Reaktionsspektrum dieses katalytischen Zentrums (ausgestattet mit der hoch-aciden Asparaginsäure) untersucht. Durch die Verwendung verschiedener bioinformatischer Methoden wurden Proteinsequenzen evolutionär verwandter Enzyme ermittelt. Somit wurde eine Superfamilie an protonierenden Enzymen (Protonasen) identifiziert und bezüglich deren beschriebener Funktionen analysiert. Diese Studien zeigen, dass sich das Reaktionsspektrum dieser Protonase-Superfamilie in der Natur auf die Polyzyklisierung einiger weniger linearer Terpene beschränkt, ganz im Gegensatz zu der enormen Diversität Brønsted-Säure-katalysierter Reaktionen in der organischen Chemie. Das Substratspektrum der SHCs und dabei besonders des Enzymes aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurde in der Vergangenheit mehrfach adressiert, wobei sich die Studien auf Polyzyklisierungen Squalen-artiger Substratanaloga beschränkten. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Substratspektrum für Polyzyklisierungsreaktionen auf funktionalisierte Polyprenoide erweitert. Insbesondere wurde gezeigt, dass Aromaten und Amide als Nukleophile in der kationischen Polyzyklisierung verwendet werden können, um die Reaktionen zu terminieren. Somit sind formal die stereoselektive Friedel-Crafts-Alkylierung sowie die Hydroamidierung Bestandteil des Reaktionsportfolios der SHCs. Neben der AacSHC wurde in diesem Teil der Arbeit auch eine weitere SHC aus Zymomonas mobilis (ZmoSHC1) verwendet, wobei sich beide Enzyme nur minimal in ihren Funktionen unterschieden. Das Substratspektrum der SHCs ist bezüglich der Substratgröße beschränkt. Während sich mittelgroße Sesqui- und Diterpen-Derivate selektiv und mit guter Aktivität zu bi- und trizyklischen Verbindungen umsetzen lassen, werden Monoterpen-Derivate von den Wildtyp-Enzymen nicht zu den entsprechenden chiralen Cyclohexanoiden zyklisiert. Synthetisierte Modellsubstrate wurden in einem dritten Teil dieser Arbeit verwendet, um diese Limitierung zu untersuchen. Hierzu wurden die Aktivitäten bei enzymatischen Umsetzungen mit molekulardynamischen Simulationen verglichen. Somit wurde ein Zusammenhang zwischen der Substratbindung in einer reaktiven Konformation und der jeweiligen Aktivität aufgezeigt. Daraus lässt sich ableiten, dass vermutlich nicht die katalytische Maschinerie die SHCs auf die Polyzyklisierungschemie beschränkt, sondern die Struktur des hochselektiven aktiven Zentrums. Dieses aktive Zentrum diskriminiert nicht-natürliche Substrate durch die limitierte Fähigkeit diese in einer reaktiven Konformation zu binden. Um SHCs zu „Protonasen“ für unterschiedliche nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln, ist deshalb ein breites Set an unterschiedlichen Geometrien des aktiven Zentrums nötig. Dementsprechend lassen sich potentielle Substrate für unterschiedliche Reaktionstypen mit einer höheren Wahrscheinlichkeit in einer reaktiven Konformation binden. Jedoch sind die aktiven Zentren der SHCs und auch verwandter Triterpen-Zyklasen hochkonserviert. Die nötige Diversität an Enzymen lässt sich somit nicht aus dem natürlichen Pool an Katalysatoren rekrutieren. Aus diesem Grund wurde in einem vierten Teil der Arbeit eine Mutantenbibliothek der AacSHC erstellt. Mit einer rationalen Mutationsstrategie (hydrophobe Substitution) wurde die AacSHC zu einem Set an hochselektiven „Protonasen“ entwickelt und damit die Anwendbarkeit als chirale Brønsted-Säure in der asymmetrischen Katalyse untersucht. Die erzeugten Varianten zeigten Aktivitäten für unterschiedliche chemische Transformationen bei gleichzeitiger Protonierung verschiedener funktioneller Gruppen (Alken, Epoxid und Carbonyl). Dies ermöglichte die Darstellung interessanter Cyclohexanoide mit guten Aktivitäten und exzellenten Stereoselektivitäten (>99 % ee/de). Die praktische Anwendbarkeit wurde in semi-präparativen Umsetzungen aufgezeigt. So wurde zum Beispiel 512 mg Geraniol mit der Variante AacSHC G600F zu einem Cyclohexanoid umgesetzt (32 % isolierte Ausbeute). Demzufolge wurde durch die Einführung einer Punktmutation ein beinahe inaktives Wildtyp-Enzym zu einem praktisch anwendbaren Katalysator evolviert. Verdeutlicht werden die exzellenten Selektivitäten (Regio-, Stereo- und Produktselektivitäten) durch die exklusive Umsetzung von (S)-6,7-Epoxygeraniol aus dem entsprechenden Racemat (inklusive der regioselektiven Deprotonierung des Carbokation-Intermediates), die hochstereoselektive Synthese (>99 % de) von (-)-iso-Isopulegol aus (S)-Citronellal oder durch die stereoselektive Wasseraddition an das Carbokation-Intermediat der Zyklisierung von Geraniol. Der Ursprung der hohen Selektivitäten liegt in der Geometrie des aktiven Zentrums. Ausgehend von unterschiedlichen reaktiven Konformationen (welche zu unterschiedlichen Produkten führen können), werden die Substrate von den „Protonasen“ selektiv in einer bestimmten reaktiven Konformation gebunden und dadurch selektiv aktiviert. Zusammenfassend wurde die einzigartige Protonierungsmaschinerie der SHCs von der Polyzyklisierungschemie befreit und für nicht-natürliche Reaktionen in die asymmetrische Katalyse eingeführt. Darüber hinaus leistet diese Arbeit einen methodischen Beitrag in der Entwicklung neuer Biokatalysatoren, da sie aufzeigt, dass Enzyme und deren Katalysezentren systematisch für nicht-physiologische Reaktionen entwickelt werden können. Dies ist interessant für die Etablierung neuer Biosynthesewege sowie für die Erweiterung der Reaktionsportfolios in der organischen Synthese (Stichwort: chirale Brønsted-Säure-Katalyse in Wasser).Item Open Access A model of the pressure dependence of the enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards (±)-menthol(2001) Kahlow, Ulrich; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenTransesterification of (±)-menthol using propionic acid anhydride and Candida rugosa lipase was performed in chloroform and water at different pressures (1, 10, 50, and 100 bar) to study the pressure dependence of enantioselectivity E. As a result, E significantly decreased with increasing pressure from E=55 (1 bar) to E=47 (10 bar), E=37 (50 bar), and E=9 (100 bar). In order to rationalize the experimental findings, molecular dynamics simulations of Candida rugosa lipase were carried out. Analyzing the lipase geometry at 1, 10, 50, and 100 bar revealed a cavity in the Candida rugosa lipase. The cavity leads from a position on the surface distinct from the substrate binding site to the core towards the active site and is limited by F415 and the catalytic H449. In the crystal structure of the Candida rugosa lipase, this cavity is filled with 6 water molecules. The number of water molecules in this cavity gradually increased with increasing pressure: 6 molecules in the simulation at 1 bar, 10 molecules at 10 bar, 12 molecules at 50 bar, and 13 molecules at 100 bar. Likewise, the volume of the cavity progressively increased from about 1864 ų in the simulation at 1 bar to 2529 ų at 10 bar, 2526 ų at 50 bar, and 2617 ų at 100 bar. At 100 bar, one water molecule slipped between F415 and H449, displacing the catalytic histidine side chain and thus opening the cavity to form a continuous water channel. The rotation of the side chain leads to a decreased distance between the H449-N and the (+)-menthyl-oxygen (non-preferred enantiomer) in the acyl enzyme intermediate, a factor determining the enantioselectivity of the lipase. While the geometry of the preferred enantiomer is similar in all simulations, the geometry of the non-preferred enantiomer gets gradually more reactive. This observation correlates with the gradually decreasing enantioselectivity E.Item Open Access Studie zur Entwicklung eines neuen Biokatalysators zur Darstellung von vicinalen Aminoalkoholen(2015) Stahmer, Juliane; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Das Ziel der Biokatalyse ist der Einsatz von Enzymen in der chemischen Industrie, um großtechnische Verfahren nachhaltiger und umweltfreundlicher zu gestalten. Oft werden zur Herstellung von Bausteinen für Pharmazeutika oder Kosmetika metallabhängige oder Organokatalysatoren eingesetzt, die in ihrer Herstellung meist teuer und toxisch sind. Obwohl es bereits einige Enzyme gibt, die Anwendung finden, gibt es noch sehr viele Reaktionen, für die es noch kein enzymkatalysiertes Pendant gibt. Die Aufgabe der modernen Biokatalyse besteht also darin, Enzyme für neue nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wird daher die Entwicklung eines neuen Biokatalysators für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen untersucht und studiert. Die dabei resultierenden vicinalen Aminoalkohole sind wichtige Zwischenprodukte für verschiedene Anwendungsgebiete der chemischen Industrie. Ihre chemische Herstellung basiert auf der Verwendung von teuren und toxischen Katalysatoren oder sie laufen nicht genügend selektiv ab. Eine Möglichkeit der Entwicklung neuer Enzyme für nicht-natürliche Reaktionen stellt die Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren dar. Dies ist eine gute Option, da viele in der organischen Synthese verwendeten Aktivierungstriebkräfte, wie zum Beispiel Säurekatalyse, auch in Enzymen auffindbar sind. Die organische Chemie und das Enzymdesign finden so einen Kontaktpunkt, der im Zuge dieser Arbeit ausgenutzt werden soll. So wurden drei Ansätze entwickelt, von denen zwei auf der Nutzung bereits vorhandener katalytischer Zentren beruhen und die dritte auf dem computerbasierten de novo Enzymdesign. Es wurden zwei Enzyme ausgewählt, die bereits ein aktives katalytisches Zentrum zur Epoxidringöffnung mit Nukleophilen, wie Wasser oder Halogeniden, besitzen. Zum einen wurde die Halohydrindehalogenase aus Agrobacterium radiobacter AD1 ausgewählt, um das vorhandene Nukleophilspektrum um NH-Nukleophile, wie Amide, Amidine oder Harnstoff zu erweitern. Zum Anderen sollte das Nukleophilspektrum der Limonen-1,2-epoxidhydrolase aus Rhodococcus erythropolis DCL14 um primäre und sekundäre Amine erweitert werden. Die bestehende Konkurrenz eines neuen nicht-natürlichen Nukleophils zum Wassernukleophil sollte durch gezieltes Ändern der aktiven Taschen mittels site-directed mutagenesis und durch Immobilisationstechniken abgeschwächt oder unterdrückt werden. Allerdings führten die Reaktionen der Varianten der genannten Enzyme mit verschiedenen Epoxiden und den genannten NH-Nukleophilen nicht zum gewünschten Erfolg. Als dritter Ansatz diente die Verwendung der Rosetta Methode, die in Zusammenarbeit mit Dr. Sinisa Bjelic (University of Washington, Seattle, USA) benutzt wurde, um Enyzmmodelle in silico zu erstellen, welche gewünschte Eigenschaften für die bimolekulare Epoxidringöffnungsreaktion enthielten. Die gewählten Substrate 3-Nitrostyroloxid und 3,4-Chloromethoxyanilin zeigten bereits eine geringe unselektive Hintergrundreaktion, deren Aktivität und Selektivität durch die Verwendung von de novo Enzymen gesteigert werden sollte. Sechs der 13 synthetischen de novo Gene konnten exprimiert und aufgereinigt werden. Gegenüber der Wunschreaktion zeigten sie allerdings keine Aktivität. Mittels STD-NMR konnte gezeigt werden, dass die gewählten Substrate an eines der Enzyme binden, allerdings konnte keine Aussage darüber getroffen werden, ob sie in der aktiven Tasche binden. Eine anschließende Untersuchung der verwendeten Übergangszustände gab Aufschluss über die nicht vorhandene Aktivität. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit die auftretenden Schwierigkeiten des Enzymdesigns für neue nicht-physiologische Reaktionen gezeigt werden. Es konnte zwar kein neuer Biokatalysator für die Epoxidringöffnungsreaktion mit Aminen entwickelt werden, jedoch zeigten die Untersuchungen die Schwachstellen auf, die nun in zukünftigen Arbeiten in diesem Gebiet umgangen werden können.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.