Universität Stuttgart
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Item Open Access Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings(2004) Rusnak, Monika; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert. Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Modellierung der Adsorption von Proteinen an Oberflächen(2009) Steudle, Alexander Patrick; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Die Adsorption von Proteinen an Oberflächen ist ein äußerst komplexer Prozess, der in vielen Bereichen, wie der Medizin, Pharmazie, Nanotechnologie und Biotechnologie, von großer Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden zur Vorhersage der Orientierung und des Bindungsverhaltens von Proteinen bei der Adsorption entwickelt. Die Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Gebiete der Ionenaustauschchromatografie, der hydrophoben Interaktionschromatografie und der Immobilisierung. Als untersuchte Proteine wurden Hühnereiweiß-Lysozym, die Hämdomäne der bakteriellen Cytochrom P450-BM3 Monooxygenase und humane monoklonale Antikörper verwendet. Lysozym gehört zu den am besten charakterisierten und meisten analytisch verwendeten Proteinen, da es billig und in großen Mengen hergestellt werden kann. Viele bisherige Untersuchungen wurden mit Lysozym durchgeführt und die adsorbierte Orientierung auf Kationenaustauschern konnte experimentell bestimmt werden. Der Adsorptionsvorgang von Cytochrom P450-BM3 ist von Interesse bei Immobilisierungen, welche zu verbesserten Eigenschaften bei Betrieb und Lagerung sowie zu einer einfachen Separation des Produkts führen. Wichtig ist hierbei eine Orientierung des Enzyms mit freiliegendem Substratzugang. Auch bei der Bindung auf beschichteten Elektroden, durch welche sich die Möglichkeit der Entwicklung analytischer und biokatalytischer Anwendungen sowie eine einfache und billige Elektronenquelle ergibt, ist die Orientierung wichtig. Ebenso wie der Substratzugang ist hier die korrekte Orientierung des elektronenakzeptierenden Bereichs wichtig, da dieser mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt stehen sollte. Antikörper gehören zu den am häufigsten eingesetzten therapeutischen Proteinen. Ihre Produktion ist teuer, da sie meist über Protein A aufgereinigt werden. Es besteht großes Interesse an billigeren alternativen Verfahren, wie der Ionenaustauschchromatografie. Früher wurden Adsorptionsprozesse meist mit vereinfachten Modellen eines Proteins, beispielweise als kugelförmiges Gebilde, modelliert. Durch die zunehmende Aufklärung der Proteinstrukturen in atomarer Auflösung wurden auch weiter entwickelte Adsorptionsmodelle erstellt, jedoch wurden Proteine dabei meist als unflexible Objekte modelliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es durch ein unflexibles Modell des Proteins, abhängig von der verwendeten Struktur und dem Abstand zur Oberfläche, bei der Modellierung von Adsorptionen zu Abweichungen von der experimentell bestimmten Orientierung kommen kann. Eine grobe Abschätzung der Bindungsorientierung ist bei einem kurzen Abstand aber noch möglich. Durch multiple Molekulardynamische Simulationen (MD-Simulationen), in welchen das Protein frei und flexibel an die Oberfläche binden konnte, hat sich am Beispiel Lysozym gezeigt, dass der Mittelwert der festgestellten gebundenen Orientierungen mit der experimentell bestimmten Orientierung, unabhängig von der zu Beginn verwendeten Proteinstruktur, übereinstimmte. Im Vergleich zeigten verschiedenen Proteine auch ein unterschiedliches Bindungsverhalten. Während bei Lysozym die Simulationen über einer negativ geladenen Oberfläche nur ein ähnliches Bindungsverhalten mit ähnlichen Bindungsorientierungen zeigte, erfolgte die Bindung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne auf einer positiv geladenen Oberfläche aufgrund ihres starken Dipolmoments immer in gleicher Weise und mit gleicher Orientierung. Die Orientierung der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne in der frühen Phase der Bindung konnte auch mittels der rigiden Bestimmungsmethode festgestellt werden. Ein Kippen der kompletten Proteinstruktur nach dem ersten Kontakt zur Oberfläche wurde jedoch nur mittels MD-Simulationen vorhergesagt. Es konnte am Modell gezeigt werden, dass die adsorbierte Orientierung auf einer positiv geladenen Oberfläche zu einer Beeinträchtigung des Substratzugangs führt und, im Falle der Immobilisierung auf einer positiv geladenen Adsorberoberfläche, welche beispielsweise bei beschichteten Elektroden eingesetzt wird, eine ungünstige Ausgangsorientierung für die Elektronenübertragung vorliegt. Mittels MD-Simulationen der Cytochrom P450-BM3-Hämdomäne über verschiedenen Anionenaustauscherliganden konnte eine Korrelation der Bindungsenergien bei verschiedenen Salzkonzentrationen mit experimentell gemessenen chromatografischen Daten bestimmt werden. MD-Simulationen mit Antikörper waren durch die rechenintensiven, langreichweitigen Wechselwirkungen zwischen Adsorber und Protein im Rahmen der zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten nicht durchführbar. Es konnten dennoch die Regionen, die bei der Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatografie Einfluss auf die Retention nehmen und somit für eine Optimierung des Proteins für den Aufreinigungsprozess infrage kommen, beispielsweise durch gezielte Mutationen in diesem Bereich, an der Proteinoberfläche mittels eines starren Modells bestimmt werden.Item Open Access Functional role of lanthanides in enzymatic activity and transcriptional regulation of Pyrroloquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenases in Pseudomonas putida KT2440(2017) Wehrmann, Matthias; Billard, Patrick; Martin-Meriadec, Audrey; Zegeye, Asfaw; Klebensberger, JanoschThe oxidation of alcohols and aldehydes is crucial for detoxification and efficient catabolism of various volatile organic compounds (VOCs). Thus, many Gram-negative bacteria have evolved periplasmic oxidation systems based on pyrroloquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenases (PQQ-ADHs) that are often functionally redundant. Here we report the first description and characterization of a lanthanide-dependent PQQ-ADH (PedH) in a nonmethylotrophic bacterium based on the use of purified enzymes from the soil-dwelling model organism Pseudomonas putida KT2440. PedH (PP_2679) exhibits enzyme activity on a range of substrates similar to that of its Ca2+-dependent counterpart PedE (PP_2674), including linear and aromatic primary and secondary alcohols, as well as aldehydes, but only in the presence of lanthanide ions, including La3+, Ce3+, Pr3+, Sm3+, or Nd3+. Reporter assays revealed that PedH not only has a catalytic function but is also involved in the transcriptional regulation of pedE and pedH, most likely acting as a sensory module. Notably, the underlying regulatory network is responsive to as little as 1 to 10 nM lanthanum, a concentration assumed to be of ecological relevance. The present study further demonstrates that the PQQ-dependent oxidation system is crucial for efficient growth with a variety of volatile alcohols. From these results, we conclude that functional redundancy and inverse regulation of PedE and PedH represent an adaptive strategy of P. putida KT2440 to optimize growth with volatile alcohols in response to the availability of different lanthanides.Item Open Access Systematische Analyse von Epoxidhydrolasen : Erstellung einer familienspezifischen Datenbank, Entwicklung einer strukturbezogenen Klassifizierung und Amplifikation unbekannter Epoxidhydrolasen(2003) Barth, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Laufe dieser Arbeit wurde eine systematische Analyse an 93 Epoxidhydrolase (EH) Sequenzen durchgeführt. Ein Vergleich der drei bekannten EH Strukturen aus Agrobacterium radiobacter, Mus musculus und Aspergillus niger zeigte die hohe Konservierung des a/b Hydrolase Folds und die Existenz zweier variabler Loop-Regionen, dem NC-und dem Cap-Loop. Aus dem Multisequenz-Alignment der 93 EHs wurden die Loop-Längen aller EHs bestimmt und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Hierbei bildeten sich drei nach Superfamilien und Organismengruppen getrennte Cluster. Jedes Cluster enthält eine der drei bekannten Strukturen. Unter der Annahme, dass ähnliche Loop-Längen eine ähnliche Struktur bedingen, konnten Homologiemodelle von fünf EHs erstellt werden. Vergleiche der Substratspektren mit der Cluster Zugehörigkeit führten zu der Annahme, dass Loop-Länge und Substratspezifität korrelieren, da z.B. nur für EHs mit langen Cap-Loops der Umsatz epoxidierter Fettsäuren beschrieben wurde. Mit dem Programm CODEHOP wurden degenerierte familienspezifische Primer erstellt und an zwei bakteriellen Organismen getestet. Aus Streptomyces antibioticus Tü4, welcher eine EH Aktivität gegen Styroloxid aufweist und Rhodococcus ruber LU760 konnten jeweils Fragmente mit signifikanter Homologie zu EHs amplifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befaßt sich mit der Erstellung und Auswertung einer familienspezifischen Datenbank auf der Grundlage der Lipase Engineering Database (LED). Die Epoxidhydrolase/Haloalkandehalogenase (EH/HD) Datenbank enthält 397 Sequenz-einträge, 305 Proteineinträge und für 19 dieser Proteineinträge 51 Strukturdatensätze. Neben EHs und HDs enthält die Datenbank weitere Enzymfamilien, die in 14 homologe Familien und zwei Superfamilien eingeteilt wurden. Untersuchungen der Strukturen aus EH/HD Datenbank und LED zeigten, dass trotz massiver struktureller Unterschiede, zwischen den Strukturen dieser beiden Datenbanken, das katalytische Zentrum strukturell in allen a/b Hydrolasen erhalten ist. Auch das für Lipasen ermittelte Anker-Konzept für die Stabilisierung des Oxyanionholes greift bei den Proteinen der EH/HD Datenbank. Für das hochkonservierte GXGXS-Motiv konnte eine mögliche strukturrelevante Funktion entwickelt werden, die seine konservierte Struktur und Lage erklärt.Item Open Access Engineering thermal stability and solvent tolerance of the soluble quinoprotein PedE from Pseudomonas putida KT2440 with a heterologous whole-cell screening approach(2018) Wehrmann, Matthias; Klebensberger, JanoschDue to their ability for direct electron transfer to electrodes, the utilization of rare earth metals as cofactor, and their periplasmic localization, pyrroloquinoline quinone‐dependent alcohol dehydrogenases (PQQ‐ADHs) represent an interesting class of biocatalysts for various biotechnological applications. For most biocatalysts protein stability is crucial, either to increase the performance of the protein under a given process condition or to maximize robustness of the protein towards mutational manipulations, which are often needed to enhance or introduce a functionality of interest. In this study, we describe a whole‐cell screening assay, suitable for probing PQQ‐ADH activities in Escherichia coli BL21(DE3) cells, and use this assay to screen smart mutant libraries for increased thermal stability of the PQQ‐ADH PedE (PP_2674) from Pseudomonas putida KT2440. Upon three consecutive rounds of screening, we identified three different amino acid positions, which significantly improve enzyme stability. The subsequent combination of the beneficial mutations finally results in the triple mutant R91D/E408P/N410K, which not only exhibits a 7°C increase in thermal stability but also a twofold increase in residual activity upon incubation with up to 50% dimethyl sulfoxide (DMSO), while showing no significant difference in enzymatic efficiency (kcat/KM).Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Studien zum Einsatz von enzymatischen Lewis- und Brønsted-Säuren in Carbonyl-aktivierten organischen Reaktionen(2016) Bischoff, Jennifer N.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Expression, Charakterisierung und Optimierung mikrobieller Laccasen für die Biokatalyse(2008) Koschorreck, Katja; Schmid, Rolf D. (Prof.)Laccasen (E.C. 1.10.3.2.) gehören zu den Multikupferoxidasen und katalysieren die Ein-Elektron-Oxidation von vier Substratmolekülen durch die Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Besonders aus Weißfäulepilzen wurden viele Laccasen beschrieben und in der Biokatalyse eingesetzt. Bisher wurden jedoch hauptsächlich natürlich vorkommende Mischungen von Laccasen aus Weißfäulepilzen und nicht isolierte Enzyme verwendet. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Laccasen aus verschiedenen Mikroorganismen exprimiert und charakterisiert sowie auf ihre Einsetzbarkeit in der Biokatalyse untersucht werden. Die Aktivität der Laccasen bei der oxidativen Kupplung phenolischer Säuren sowie der Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe stand dabei im Vordergrund. Zudem sollte die häufig geringe Expression der Laccasen verbessert und gemeinsam mit der Aktivität der Enzyme über gezielte Mutagenese oder Zufallsmutagenese gesteigert werden. Vier verschiedene Laccasen aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor, Lccalpha, Lccbeta, Lccgamma und Lccdelta, wurden erfolgreich in Pichia pastoris überexprimiert. Die Wahl der Signalsequenz zur Sekretion in P. pastoris sowie die Temperatur hatten einen großen Einfluss auf die Expression der Laccasen. Durch Hochzelldichte-Kultivierungen von P. pastoris wurden hohe Ausbeuten der Laccasen von bis zu 3400 U l–1 erzielt, die den biotechnologischen Einsatz dieser Enzyme realisierbar machen. Die biochemische Charakterisierung der Laccasen ergab, dass Lccalpha und Lccbeta bei Raumtemperatur wie auch bei höheren Temperaturen deutlich stabiler als Lccgamma und Lccdelta waren. Zudem zeigten die Laccasen sehr unterschiedliche katalytische Aktivitäten. Obwohl alle vier Isoenzyme die oxidative Phenolkupplung von 5 mM Sinapinsäure regioselektiv zum Dehydrodisinapinsäuredilakton katalysierten, zeigte Lccdelta mit 98% Umsatz nach 20 min die höchste Aktivität. Lccalpha, Lccbeta und Lccgamma wiesen nach 20 min 34%, 50% bzw. 48% Umsatz auf. Die Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasser-stoffe erfolgte hingegen am effektivsten mit Lccbeta. Durch Einsatz des Redoxmediators 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS) wurde mit Lccbeta nach 72 h über 80% Umsatz von 0,1 mM Anthracen, Acenaphthen und Acenaphthylen erzielt und damit deutlich bessere Ergebnisse erreicht als bisher mit Laccase-Mischungen aus T. versicolor und ABTS. Lccbeta wurde somit als stabilste Laccase aus T. versicolor mit hoher Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten identifiziert und ist potenziell für einen Einsatz in der Biokatalyse geeignet. Strukturelle Analysen der Laccasen und anschließende Mutagenese zeigten, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der Laccasen gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen durch die Aminosäuren an Position 164 und 265 in der Substratbindetasche verursacht werden. Des Weiteren wurde eine neue Laccase aus Bacillus licheniformis identifiziert und erfolgreich in Escherichia coli überexprimiert. Das Enzym CotA katalysierte die oxidative Kupplung verschiedener phenolischer Säuren, allerdings war die Aktivität des Enzyms stark von der Alkylkettenlänge der Säureseitengruppe wie auch von den Substituenten in ortho-Position der Phenolgruppe abhängig. So wurden 5 mM Sinapinsäure, Kaffeesäure und Ferulasäure von CotA nach 120 min zu 66%, 22% bzw. 15% umgesetzt, während p-Cumarsäure, Zimtsäure und Vanillinsäure nicht oxidiert wurden. Als Hauptprodukte der Kupplungsreaktionen wurden Dimere der Säuren identifiziert. Die höchste Regioselektivität bei der oxidativen Phenolkupplung wurde bei der Oxidation von Sinapinsäure zum Dehydrodisinapinsäure-dilakton erreicht (79% Anteil am Gesamtprodukt). Syringasäure wurde von CotA ausschließ-lich zum 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinon oxidiert (22% Umsatz nach 120 min). CotA wurde durch Zufallsmutagenese (error-prone PCR) verändert und 6000 CotA-Varianten im Hochdurchsatzverfahren auf verbesserte Aktivität gegenüber ABTS untersucht. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurde anschließend über einen rationalen Ansatz die CotA-Variante K316N/D500G erzeugt. Diese konnte 11,4-mal so stark wie der Wildtyp exprimiert werden. Das bedeutet, dass circa 300 mg aktive Laccase aus 1 l E. coli-Kultur erhalten werden können. K316N/D500G zeigte zudem eine um circa 50% höhere spezifische Aktivität bei der oxidativen Phenolkupplung von Ferulasäure als der Wildtyp. Die Aktivität gegenüber Kaffeesäure war leicht erhöht (20% Umsatz gegenüber 18% Umsatz mit CotA). Außerdem wurden die Farbstoffe Remazol Brilliant Blue R, Alizarin Red S und Indigocarmin von K316N/D500G sowohl in An- wie in Abwesenheit des Redoxmediators Violursäure deutlich stärker entfärbt als von CotA-Wildtyp. Die verbesserten Eigenschaften der CotA-Variante K316N/D500G ermöglichen den Einsatz dieser bakteriellen Laccase in der Biokatalyse.Item Open Access Transkriptomanalyse von Escherichia coli unter Kohlenhydrat-Limitierung mittels DNA-Microarrays(2006) Lemuth, Karin; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Escherichia coli weist unter Glukose-Limitierung (Konzentrationen unter 0,05 g/L) zahlreiche physiologische Veränderungen auf. Man unterscheidet die ppGpp-vermittelte Stringente Kontrolle, die cAMP/CRP-vermittelte Hungerantwort, die Cra-vermittelte Antwort zur Anpassung des Kohlenstoffflusses sowie die sogenannte "Starvation". Eine eindeutige Differenzierung der verschiedenen Stressantworten in E. coli unter Glukose-Limitierung sowie deren zeitliche Zuordnung ist bisher aufgrund methodischer Schwierigkeiten nicht hinreichend möglich. In diskontinuierlichen Batch-Kultivierungen verläuft speziell die Hungerantwort, begleitet durch das rasche Abfallen der Wachstumsrate, zeitlich eng begrenzt und ist somit experimentell schwer zu erfassen. Ziel der vorliegenden Dissertation war eine genauere Charakterisierung der physiologischen Antwort von E. coli auf eine Glukose-Limitierung. Die Anpassung der Zelle sollte auf Transkriptom-Ebene mit Hilfe von eigens hergestellten gesamtgenomischen DNA-Microarrays analysiert werden. Die Zellproben wurden aus drei Fermentationen gewonnen. Die Glukose-Limitierung wurde durch eine gekoppelte Batch/Fed-Batch-Prozessführung mit konstanter Zulaufrate ausgelöst und erlaubte eine Probenentnahme bei stetig sinkender Wachstumsrate sowie die Kontrolle verschiedener Parameter wie der Glukose-Konzentration, des pH-Wertes und der O2/CO2-Konzentration. Über einen Zeitraum von etwa neun Stunden wurden acht verschiedene Kulturproben unter Glukose-Limitierung sowie eine Probe aus der unlimitierten Wachstumsphase als Referenzprobe entnommen und Expressionsanalysen über DNA-Microarrays durchgeführt. Eine statistische Analyse der dabei erzeugten Daten ergab signifikante Unterschiede für 962 Transkripte unter Glukose-limitierten Bedingungen im Vergleich zur Referenz in mindestens einem Zeitpunkt. 367 der 962 Transkripte kodierten für hypothetische Proteine bzw. Proteine mit noch unbekannter Funktion. Die Gene der übrigen 595 Transkripte konnten verschiedenen physiologischen Funktionen (Anabolismus, Katabolismus, Zentraler Kohlenstoffwechsel, Transport, Proteinbiosynthese, Zellteilung, Stressantwort, Flagellen- und Chemotaxis System, Regulation sowie weitere Proteine) zugeordnet werden. Um Aussagen über aktive Regulatoren unter Kohlenhydrat-Limitierung zu machen, wurde deren regulatorische Aktivität in der vorliegenden Arbeit indirekt bestimmt. Die potentielle regulatorische Aktivität sechs verschiedener Sigma-Faktoren sowie weiterer 28 Regulatoren konnte nachgewiesen werden. Folgendes Bild über die Anpassung von E. coli auf eine Glukose-Limitierung kann aus den Ergebnissen abgeleitet werden: Unter Glukose-Limitierung induzierten die Zellen innerhalb der ersten Stunden eine cAMP/CRP- sowie Cra-vermittelte Hungerantwort. Ferner wurden Gene zur Umsetzung von Acetyl-CoA verstärkt transkribiert. Glykolytische Enzyme hingegen wurden größtenteils vermindert transkribiert. Die Zelle passte ihren Stoffwechsel also den verminderten Glukose-Konzentrationen im umgebenden Medium an. In der Hungerphase wurde interessanterweise trotz einer ausreichenden Ammoniumkonzentration im Medium ein physiologischer Zustand beobachtet, der einer Stickstoff-Limitierung ähnelt. Die drei, unter Stickstoff-Limitierung aktiven Systeme in E. coli (NtrC, Nac sowie SigmaN vermittelte Reaktionen) wurden aktiviert. Möglicherweise stellt diese Reaktion neben der cAMP/CRP-vermittelten Antwort eine weitere Möglichkeit für E. coli dar, Kohlenstoffquellen zu erschließen, da die Kohlenstoffgerüste zahlreicher Aminosäuren zur Energiegewinnung oxidiert werden können. Unter Glukose-Limitierung konnte ferner über den gesamten betrachteten Zeitraum eine der Stringenten Kontrolle zuzuordnende differentielle Expression beobachtet werden. Entgegen den Erwartungen wurde vorwiegend eine herabgesetzte Synthese der mRNA für Enzyme der Aminosäurebiosynthese nachgewiesen. Weiterhin war die Stringente Kontrolle nicht an eine Regulation der Physiologie durch SigmaS gekoppelt. Zu einem späteren Zeitpunkt unter Kohlenstoff-Limitierung synthetisierten die Zellen trotz ausreichender Sauerstoff-Konzentration im Bioreaktor mRNA, die für anaerobe Enzyme kodiert. Dies spricht für eine Zell-Antwort, die normalerweise unter anaeroben Bedingungen beobachtet werden kann. Vermittelt wurde diese Zell-Antwort möglicherweise durch das Fermentations/Atmungs-Umschaltprotein (FrsA) welches auf einen veränderten Glukose-Transport reagiert und der Zelle ein Umschalten zwischen Fermentation und Atmung ermöglicht. Die vorliegenden Ergebnisse lassen auf ein Umschalten des Proteins auch zwischen aerober Atmung und anaerober Atmung schließen. Die Microarray-Analyse ergab weiterhin Hinweise auf die Regulation verschiedener Proteine unter Kohlenhydrat-Limitierung, die bisher als nicht reguliert galten bzw. entgegen der erwarteten Regulation reguliert wurden.