Universität Stuttgart
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Item Open Access Etablierung von neuen Methoden zur Herstellung rekombinanter Antikörper und zur spezifischen Selektion von Antikörpervarianten im hohen Durchsatz(2002) Lange, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst rekombinante herbizidspezifische Antikörperfragmente (single chain Fragmente und Fab Fragmente) in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Dies gelang jeweils durch genomische Integration der codierenden Gene. Im Fall des atrazinspezifischen Fabs K411B wurden hierfür mehrere Vektoren hergestellt, die jeweils die Gene beider Ketten als Fusion mit der a-Faktor-Signalsequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors enthielten. Somit konnten nach Transformation eines einzigen Vektors in Pichia beide Antikörperketten exprimiert und ins Medium sekretiert werden. Es zeigte sich, daß Klone mit beiden Genen unter Kontrolle des methanolinduzierbaren AOX1 Promotors größere Mengen Fab exprimierten, als solche mit den Antikörpergenen unter Kontrolle des konstitutiven GAPDH-Promotors. Durch fed-batch Kultivierung im 5l Bioreaktor konnten schließlich 40 mg l-1 Fab exprimiert werden. Wie sich durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte, bildeten ca. 30 % der schweren und leichten Ketten komplette Fab Fragmente. Auch im Falle des scFv K411B konnte mit Klonen, die das scFv-Gen als Fusion mit dem a-Faktor unter Kontrolle des AOX1-Promotors genomisch integriert trugen deutlich mehr exprimiert werden. Die Bindungseigenschaften des scFv und des Fab K411B wurden mit einem direkten, kompetitiven ELISA bestimmt: Wie erwartet zeigten beide Antikörperfragmente Testmittelpunkte von ca. 3 µg l-1. Dieser lag damit jedoch um ca. eine Größenordnung höher, als der mit dem parentalen monoklonalen Antikörper K4E7 gemessene Wert von ca. 0,2 µg l-1. Die Kreuzreaktivitäten der verschiedenen rekombinanten Antikörper stimmten jedoch nahezu mit denen des mAk überein. Die Entfernung mehrerer Restriktionsschnittstellen in dem für die Expression des Fab K411B hergestellten Expressionsvektor ermöglichte dessen Verwendung zur Herstellung von Fab Fragmenten beliebiger Spezifität durch einfachen Austausch der nun durch singuläre Schnittstellen begrenzten variablen Domänen. Dies wurde durch Expression eines 2,4-D-spezifischen Fabs validiert. Obwohl die exprimierte Menge deutlich geringer, als die des Fab K411B war, konnte mittels ELISA eine sigmoidale Bindungskurve zur Bestimmung von 2,4-D erstellt werden, aus der sich ein Testmittelpunkt von ca. 10 µg l-1 ergab. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neben dem ELISA weitere Methoden zur Messung der Bindungseigenschaften von Antikörpern etabliert und bezüglich ihrer Eignung zum Screening von Antikörperbibliotheken in hohem Durchsatz getestet: Zunächst wurde ein auf Fluoreszenzpolarisation beruhender homogener, kompetitiver Assay entwickelt. Mit einem Testmittelpunkt von ca. 90 µg l-1 bei der Bestimmung von Atrazin wäre für Anwendungen in der Umweltanalytik jedoch eine Optimierung hinsichtlich einer verbesserten Sensitivität notwendig. Aufgrund seiner im Vergleich zum ELISA sehr schnellen Durchführbarkeit, wäre der Einsatz als Schnelltest im mittleren Durchsatz geeignet und weniger für ein Screening im hohen Durchsatz, da die Ergebnisse im Vergleich zum ELISA weniger genau und reproduzierbar waren. Zum Screening von Antikörperbibliotheken und zur Selektion von Varianten mit bestimmten Bindungseigenschaften im hohen Durchsatz, wie es für evolutive Methoden erforderlich ist, wurde ein Hefeoberflächenexpressionssystem etabliert. Diese mit dem Phagen-Display verwandte Methode ist im Gegensatz zum ELISA und zum Fluoreszenzpolarisationstest vom Mikrotiterplattenformat unabhängig, da die Bestimmung der Bindungseigenschaften sowie die Selektion von Varianten mit dem Durchflußcytometer erfolgt: Durch Fusion der Gene der scFv's mit dem Gen einer Domäne des Agglutininrezeptors gelang nach Transformation des Fusionsgenes die Expression und Präsentation des daraus resultierenden funktionellen Fusionsproteins auf der Hefeoberfläche. Die damit erreichte Kopplung von Geno- und Phänotyp erlaubt durch Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antigenen und/oder Epitop-spezifischen Antikörpern und nachfolgender Analyse und Sortierung am Durchflußcytometer das Screening und die Selektion von Hefezellen, die Antikörper mit speziellen Bindungseigenschaften exprimieren. Die erfolgreiche funktionelle Expression der verschiedenen scFv's auf der Hefeoberfläche wurde durch Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Laserscanning-Mikroskopie sowie FACS-Messungen überprüft und bestätigt. Eine Vereinfachung der Screeningmethode wurde durch Expression des scFv-EGFP auf der Oberfläche der Zellen erreicht: Damit kann auf die für die Bestimmung der Oberflächenexpressionsmenge notwendige Markierung der scFv's mit Epitop-spezifischen fluorezenzmarkierten Antikörpern verzichtet werden, da die Fluoreszenz des EGFP-Anteils direkt mit der Menge des exprimierten Fusionsproteins korreliert.