Universität Stuttgart
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Item Open Access The Lipase Engineering Database – a navigation and analysis tool for protein families(2003) Fischer, Markus; Pleiss, JürgenThe Lipase Engineering Database (http://www.led.uni-stuttgart.de) integrates information on sequence, structure, and function of lipases, esterases, and related proteins. Sequence data on 806 protein entries are assigned to 38 homologous families, which are grouped into 16 superfamilies with no global sequence similarity between each other. For each family, multisequence alignments are provided with functionally relevant residues annotated. Pre-calculated phylogenetic trees allow navigation inside superfamilies. Experimental structures of 45 proteins are superposed and consistently annotated. The Lipase Engineering Database has been applied to systematically analyze sequence-structure-function relationships of this vast and diverse enzyme class. It is a useful tool to identify functionally relevant residues apart from the active site residues, and to design mutants with desired substrate specificity.Item Open Access How to find soluble proteins : a comprehensive analysis of alpha/beta hydrolases for recombinant expression in E. coli(2005) Koschorreck, Markus; Fischer, Markus; Barth, Sandra; Pleiss, JürgenBackground: In screening of libraries derived by expression cloning, expression of active proteinsin E. coli can be limited by formation of inclusion bodies. In these cases it would be desirable to enrich gene libraries for coding sequences with soluble gene products in E. coli and thus to improve the efficiency of screening. Previously Wilkinson and Harrison showed that solubility can be predicted from amino acid composition (Biotechnology 1991, 9(5):443-448). We have applied this analysis to members of the alpha/beta hydrolase fold family to predict their solubility in E. coli. alpha/beta hydrolases are a highly diverse family with more than 1800 proteins which have been grouped into homologous families and superfamilies. Results: The predicted solubility in E. coli depends on hydrolase size, phylogenetic origin of the host organism, the homologous family and the superfamily, to which the hydrolase belongs. In general small hydrolases are predicted to be more soluble than large hydrolases, and eukaryotic hydrolases are predicted to be less soluble in E. coli than prokaryotic ones. However, combining phylogenetic origin and size leads to more complex conclusions. Hydrolases from prokaryotic, fungal and metazoan origin are predicted to be most soluble if they are of small, medium and large size, respectively. We observed large variations of predicted solubility between hydrolases from different homologous families and from different taxa. Conclusion: A comprehensive analysis of all alpha/beta hydrolase sequences allows more efficient screenings for new soluble alpha/beta hydrolases by the use of libraries which contain more soluble gene products. Screening of hydrolases from families whose members are hard to express as soluble proteins in E. coli should first be done in coding sequences of organisms from phylogenetic groups with the highest average of predicted solubility for proteins of this family. The tools developed here can be used to identify attractive target genes for expression using protein sequences published in databases. This analysis also directs the design of degenerate, family- specific primers to amplify new members from homologous families or superfamilies with a high probability of soluble alpha/beta hydrolases.Item Open Access Molecular modelling of family GH16 glycoside hydrolases : potential roles for xyloglucan endotransglucosylases/hydrolases in cell wall modification in the Poaceae(2004) Strohmeier, Marco; Hrmova, Maria; Fischer, Markus; Harvey, Andrew J.; Pleiss, Jürgen; Fincher, Geoffrey B.Family GH16 glycoside hydrolases can be assigned to five sub-groups according to their substrate specificities, including xyloglucan endotransglucosylases/hydrolases (XTHs), (1,3)-β- galactanases, (1,4)-β-galactanases/κ-carrageenases, “non-specific” (1,3/1,3;1,4)-β-D-glucan endohydrolases and (1,3;1,4)-β-D-glucan endohydrolases. A structured family GH16 glycoside hydrolase database has been constructed (http://www.ghdb.uni-stuttgart.de) and provides multiple sequence alignments with functionally annotated amino acid residues and phylogenetic trees. The database has been used for homology modelling of seven family GH16 glycoside hydrolases, based on structural coordinates for (1,3;1,4)-β-D-glucan endohydrolases and a κ-carrageenase. In combination with multiple sequence alignments, the models predict the three-dimensional dispositions of amino acid residues in the substrate-binding and catalytic sites of XTHs and (1,3/1,3;1,4)-β-D-glucan endohydrolases, for which no structural information is available. Furthermore, they reveal similarities with the active sites of family GH11 (1,4)-β-D-xylan endohydrolases. From a biological viewpoint, the classification and molecular modelling establish structural and evolutionary connections between XTHs, (1,3;1,4)-β-D-glucan endohydrolases and xylan endohydrolases, and raise the possibility that XTHs from higher plants could be active not only on cell wall xyloglucans, but also on (1,3;1,4)-β-D-glucans and arabinoxylans, which are major components of walls in grasses. A role for XTHs in (1,3;1,4)-β-D-glucan and arabinoxylan modification would be consistent with the apparent over-representation of XTH sequences in cereal EST databases.Item Open Access Beanspruchung eingeerdeter Rohrleitungen infolge Austrocknung bindiger Böden(2006) Fischer, Markus; Giesecke, Jürgen (Prof. em. Dr.-Ing. habil. Dr.-Ing. E. h.)Rohrnetze stellen meist das größte Anlagevermögen eines Versorgungsunternehmens dar. Ihr Zustand bestimmt die Zuverlässigkeit und Sicherheit der Versorgung wesentlich. Der Analyse von möglichen Schadensursachen und der Identifikation von Schwachstellen im Netz, die sich aus einem schlechten Leitungs- oder aus einem kritischen Beanspruchungszustand ergeben können, kommt aus diesen Gründen eine große Bedeutung zu. Eine dieser Schadensursachen ist die Beanspruchung von Rohrleitungen infolge der Austrocknung bindiger Böden. Das aus Festsubstanz und Porenraum bestehende Volumen eines bindigen Bodens ist innerhalb bestimmter Ober- und Untergrenzen abhängig von dessen Wassergehalt: Austrocknung führt zum Schrumpfen, Feuchtezunahme zum Quellen des Bodens. Trocknet ein Boden unterhalb einer Rohrleitung aus, führt dies infolge der ausgelösten Setzungsbewegungen zum Absinken dieser Leitung. Ist dieses Absinken an einer oder mehreren Stellen durch Festpunkte behindert, wird die Leitung als Träger beansprucht und somit belastet. Festpunkte, welche die Vertikalbewegung von Rohrleitungen örtlich behindern, sind insbesondere Leitungskreuzungen, Bauwerkseinführungen, Schachtbauwerke und Stellen nichtbindiger Böden sowie große Steine und Mauerwerksbestandteile. Sie sind teilweise das Resultat einer heute als nicht mehr sachgemäß erkannten Verlegeweise. Manche Arten von Festpunkten, beispielsweise Gebäudeeinführungen, sind jedoch prinzipiell nicht vermeidbar. In der vorliegenden Arbeit wird die Größenordnung der aufgrund der beschriebenen Vorgänge unter definierten Randbedingungen auftretenden Belastungen für Rohrleitungen älterer Baujahre aus Grauguss und Stahl rechnerisch untersucht. Die Betrachtungen erstrecken sich dabei auf Festpunktlagerungen, bei denen eine starre Einspannung der Rohrleitung gegeben ist. Außer der Entwicklung der Berechnungsgrundlagen erfolgt eine Beschreibung und Quantifizierung der Einflussgrößen mit Bezug auf die in städtischen Verteilnetzen gegebenen Randbedingungen. Das Schrumpfungsverhalten bindiger Böden und eine Abschätzung des möglichen Ausmaßes der resultierenden Setzungen wird anhand von Informationen aus der Fachliteratur behandelt. Auf der Basis der genannten Grundlagen wird eine Parameterstudie durchgeführt. Im Rahmen der Parameterstudie werden Berechnungsreihen gebildet, bei denen jeweils ein Einflussfaktor geändert wird, während die übrigen Parameter konstant bleiben. Ausgangspunkt der Parameterstudie ist die Betrachtung einer Graugussrohrleitung der Nennweite DN 200, die als Ausgangsbasis für die meisten Berechnungsreihen dient. Bei allen Berechnungen betrugen die Umfangsspannungen nur einen Bruchteil der Längsspannungen. Die maximalen Vergleichsspannungen traten immer in Scheitel und Sohle an der Außenseite des Rohrquerschnitts auf. Die größte Spannungskomponente war jeweils eine Längsspannung, die am Scheitel positiv (Zug) und an der Sohle negativ (Druck) war. Die durchgeführte Parameterstudie gibt weitere Hinweise zum Einfluss wesentlicher Parameter, die unter Berücksichtigung der örtlichen Betriebserfahrungen für eine differenzierte Risikobewertung verwendet werden können. Auf Basis dieser Risikobewertung kann eine Entscheidung über die Notwendigkeit von Rehabilitationsmaßnahmen erfolgen und eine zeitliche Reihenfolge für die Durchführung der als erforderlich betrachteten Maßnahmen festgelegt werden.Item Open Access RESTful BPEL - Erweiterung von BPEL zur Orchestrierung von RESTful Web Services(2013) Fischer, MarkusDie Web Service Business Process Execution Language ist eine Sprache zur Modellierung von Geschäftsprozessen, die es ermöglicht Web Services zu orchestrieren, die durch eine WSDL-Schnittstelle definiert sind. REST, die Kurzform von „REpresentational State Transfer“, ist ein Architekturstil für Webanwendungen, der bei Einhaltung unter anderem bessere Skalierbarkeit, einfachere System-Architektur und bessere Erweiterbarkeit verspricht. In dieser Arbeit wird untersucht, welche Möglichkeiten bestehen, BPEL zur Orchestrierung von RESTful Web Services zu verwenden, oder inwiefern BPEL zu diesem Zweck erweitert werden muss. Dazu werden verschiedene Konzepte beschrieben, analysiert und bewertet. Anschließend wird ein Konzept entworfen und implementiert, das alle notwendigen Anfor- derungen erfüllt, BPEL zur Orchestrierung von RESTful Web Services zu nutzen.Item Open Access Sequence and structure of epoxide hydrolases : a systematic analysis(2004) Barth, Sandra; Fischer, Markus; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenEpoxide hydrolases (EC 3.3.2.3) are ubiquitous enzymes which catalyze the hydrolysis of epoxides to the corresponding vicinal diols. Over 100 epoxide hydrolases (EH) have been identified or predicted, 3 structures are available. Although they catalyze the same chemical reaction, sequence similarity is low. To identify conserved regions, all EHs were aligned. Phylogenetic analysis identified 12 homologous families, which were grouped into 2 major superfamilies: the microsomal EH superfamily, which includes the homologous families of Mammalian, Insect, Fungal, and Bacterial EHs, and the cytosolic EH superfamily, which includes Mammalian, Plant, and Bacterial EHs. Bacterial EHs show a high sequence diversity. Based on structure comparison of 3 known structures from Agrobacterium radiobacter AD1 (cytosolic EH), Aspergillus niger (microsomal EH), and Mus musculus (cytosolic EH), and multisequence alignment and phylogenetic analysis of 95 EHs, the modular architecture of this enzyme family was analyzed. While core and cap domain are highly conserved, the structural differences between the EHs are restricted to only 2 loops: the NC-loop connecting the core and the cap and the cap-loop which is inserted into the cap domain. EHs were assigned to either of 3 clusters based on loop length. Using this classification, core and cap region of all EHs, NC-loops and cap-loops of 78% and 89% of all EHs, respectively, could be modeled. Representative models are available from the Lipase Engineering Database, http://www.led.uni-stuttgart.de.Item Open Access The database of epoxide hydrolases and haloalkane dehalogenases: one structure, many functions(2004) Barth, Sandra; Fischer, Markus; Schmid, Rolf D.; Pleiss, JürgenThe epoxide hydrolases and haloalkane dehalogenase database (EH/HD) integrates sequence and structure of a highly diverse protein family including mainly the Asp-hydrolases of EHs and HDs but also proteins like the Ser-hydrolases non-heme peroxidases, prolyl iminopetidases or 2-hydroxymuconic semialdehyde hydrolases. These proteins have a highly conserved structure, but display a remarkable diversity in sequence and function. 305 protein entries were assigned to 14 homologous families, forming two superfamilies. Annotated multisequence alignments and phylogenetic trees are provided for each homologous family and superfamily. Experimentally derived structures of 19 proteins are superposed and consistently annotated. Sequence and structure of all 305 proteins were systematically analysed. Thus, deeper insight is gained into the role of a highly conserved sequence motifs and structural elements. The EH/HD database is available at http://www.led.uni-stuttgart.de.Item Open Access Die Lipase Engineering Database : systematische Analyse familienspezifischer Eigenschaften und der Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehung von alpha/beta-Hydrolasen(2004) Fischer, Markus; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Familie der alpha/beta-Hydrolasen systematisch untersucht. Grundlage dieser Analyse war die Entwicklung eines Data Warehouse Systems zur Integration von Proteinsequenz- und Strukturdaten in Verbindung mit funktionell relevanten Informationen für große Proteinfamilien. Als Anwendung dieses Data Warehouse Systems wurde die Lipase Engineering Database (LED) erstellt, die alle Mitglieder der alpha/beta-Hydrolasen enthält. Das Release 2.3 der LED enthält 3148 Sequenzeinträge für 2313 Proteine, wobei 35% der Proteine als putativ definiert sind. Für 96 Proteineinträge sind 261 Struktureinträge in der LED abgelegt. Aufgrund der Sequenzähnlichkeit wurden die alpha/beta-Hydrolasen in 37 Superfamilien und 103 homologe Familien eingeteilt. Die LED diente zur systematischen Identifikation familienspezifischer Deskriptoren auf Sequenz- und Strukturebene. Die Bestimmung streng konservierter Positionen für acht repräsentative alpha/beta-Hydrolasesuperfamilien half bei der Identifikation des Faltungsnukleus, der den alpha/beta-Hydrolase Fold charakterisiert. Daraus konnte ein Modell für die Faltung dieser Proteine skizziert werden. Anhand der Architektur des funktionell wichtigen oxyanion holes konnten diese in drei Klassen eingeteilt werden: (1) die GGGX Klasse, für die die oxyanion hole bildende Aminosäure am C-terminalen Ende des hoch konservierten Musters GGG lokalisiert ist und von einer streng konservierten, hydrophoben Aminosäure X gefolgt wird, (2) die GX Klasse, für die die oxyanion hole Aminosäure X einem streng konserviertem Glycin folgt und (3) die Y Klasse deren oxyanion hole durch die Hydroxylgruppe eines streng konservierten Tyrosin gebildet wird. Für die strukturelle Stabilisierung des oxyanion holes der GX Klasse wurde die Wechselwirkung der Seitenkette X mit Anker Aminosäuren identifiziert. Dieses Anker-Konzept konnte experimentell durch den Austausch des Anker-Moduls in der Lipase aus Burkholderia cepacia gegen das der Lipase aus Rhizomucor miehei bestätigt werden. Die Form und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Fettsäurebindungsstelle von acht alpha/beta-Hydrolasen wurden untersucht, um deren Substratspezifität auf molekularer Ebene nachzuvollziehen. Diese konnten so in vier Gruppen eingeteilt werden und half bei der Identifikation von Aminosäuren, die für die Vermittlung der Substratkettenlängenspezifität verantwortlich sind. Für die Superfamilie der Carboxylesterasen wurden mit der in CODEHOP implementierten Methode degenerierte familienspezifischen Primer erstellt, die sich zur Identifikation neuer Carboxylesterasen in aus Bodenproben isolierter DNA eignen.Item Open Access Vergleich von Frameworks zur Implementierung von REST-basierten Anwendungen(2013) Fischer, Markus; Képes, Kálmán; Wassiljew, AlexanderMit steigender Popularität des Architekturstils "Representational State Transfer" veröffentlicht in der Dissertation "Architectural Styles and the Design of Network-based Software Architectures" von Roy T. Fielding im Jahre 2000, wurden und werden immer mehr Arbeiten veröffentlicht die sich mit dem Thema beschäftigen. Darunter befinden sich auch Frameworks und Spezifikationen, die das Entwickeln von "RESTful Services" anhand der Aspekte von REST, wie beispielsweise "Uniform Interface" erleichtern wollen. In dieser Fachstudie werden eine Reihe von Frameworks, für das Entwickeln von "RESTful Services" vorgestellt und anhand eines Kriterienkatalogs ausgewertet und bewertet. Dieser Kriterienkatalog ist in 4 Kategorien eingeteilt. Darunter fallen Kriterien bezüglich der Dokumentation des Frameworks, die mit ihnen verbundenen Entwicklungsprozesse und inwieweit die REST Prinzipien mit Hilfe des Frameworks realisiert werden können. Weiterhin werden erweiterte technische Fähigkeiten betrachtet, wie beispielsweise Entwicklungsunterstützung für transaktionales Verhalten und Asynchronität, aber auch andere wichtige Aspekte für RESTful Applikationen, wie Sicherheit und Zuverlässigkeit.Item Open Access Model-driven code generation for REST APIs(2015) Fischer, MarkusIn recent years Representational State Transfer (REST) has become more and more popular as an architecture style for web applications. An application must obey several constraints to be considered fully REST compliant. Often these constraints are only partially fulfilled by developers. These issue can be addressed by applying Model Driven Software Development to the design and development of REST applications, a technique that uses formal models to describe applications and to generate application code. The goal of this thesis is the generation of application code for REST APIs. For this, a REST compliant application is developed manually to identify good and practical source code templates that can be used for the code generation. The manually developed application is also used to derive entities for the formal model that provides the basis for code generation. The solution developed in this thesis defines a platform specific meta model for the generation of REST APIS. The solution also provides a transformation from an already existing meta model for REST APIs to the new platform specific meta model, and the transformation to application code. The solution is integrated into the existing modeling tool and thereby provides an fast and easy way to develop REST compliant applications.