Universität Stuttgart
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Item Open Access Probleme der Gestaltbildung(1990) Kull, UlrichDie Einzelheiten der Bildung komplexer Gestalten von Lebewesen können nicht vollständig genetisch fixiert sein, da hierzu die Zahl der Gene der Organismen kaum ausreichen würde. Es muß also Vorgänge der Gestaltbildung geben, die auf grund weniger genetischer Festlegungen (Randbedingungen} unter Selbstorganisation ablaufen; sie sind "systemimmanente Eigenschaften". Ein besonderes schönes Beispiel dafür liefern die Radiolarien, die schon Haeckel der ästhetisch ansprechenden Skelettformen wegen sehr schätzte.Item Open Access Regulation of the catalytic activity and specificity of DNA nucleotide methyltransferase 1(2014) Bashtrykov, Pavel; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)DNA nucleotide methyltransferase 1 (Dnmt1) is mainly responsible for the maintenance of DNA methylation in mammals and plays a crucial role in the epigenetic control of gene expression. Dnmt1 recognizes and methylates hemimethylated CpG sites formed during DNA replication. In the present work, the mechanistic details of the substrate recognition by the catalytic domain of Dnmt1, the possible role of the CXXC and RFTS domains of Dnmt1 in the regulation of specificity and activity of Dnmt1, and the influence of the Ubiquitin-like PHD and RING finger domain-containing 1 (Uhrf1) protein on the enzymatic properties of Dnmt1 was investigated. Using modified substrates, the functional roles of individual contacts of the Dnmt1 catalytic domain with the CpG site of the DNA substrate were analysed. The data show that the interaction with the 5-methylcytosine:guanine pair is required for the catalytic activity of Dnmt1, whereas the contacts to the non-target strand guanine are not important, since its replacement with adenine increased the activity of Dnmt1. It was proposed that the CXXC domain binding to unmethylated CpG sites increases the specificity of Dnmt1 for hemimethylated DNA. Our data showed that the CXXC domain does not influence the enzyme’s specificity in the full-length Dnmt1. In contrast, mutagenesis in the catalytic domain introducing an M1235S exchange resulted in a significant reduction in specificity. Therefore, the readout for the hemimethylated DNA occurs within its catalytic domain. It was observed in a crystal structure that the RFTS domain of Dnmt1 inhibits the activity of the enzyme by binding to the catalytic domain and blocking the entry of the DNA. By amino acid substitution in the RFTS domain its positioning within the catalytic domain was destabilized and a corresponding increase in the catalytic rate was observed, which supports this concept and suggests a possible mechanism to allosterically regulate the activity of Dnmt1 in cells. Uhrf1 has been shown to target Dnmt1 to replicated DNA, which is essential for DNA methylation. Here it is demonstrated that Uhrf1 as well as its isolated SRA domain increase the activity and specificity of Dnmt1 in an allosteric mechanism. The stimulatory effect was independent of the SRA domain’s ability to bind hemimethylated DNA. The RFTS domain of Dnmt1 is required for the stimulation, since its deletion or blocking of its interaction with the SRA domain, significantly reduced the ability of Uhrf1 to increase the activity and specificity of Dnmt1. Uhrf1, therefore, plays multiple roles that support DNA methylation including targeting of Dnmt1, its stimulation and an increase of its specificity.Item Open Access Insights into the structural and functional properties of the eukaryotic porin Tom40(2012) Gessmann, Dennis; Nußberger, Stephan (Prof. Dr.)Tom40 forms the preprotein conducting channel in the outer membrane of mitochondria enabling transport of up to 1500 different preproteins through an optimized pore environment. Moreover, Tom40 exhibits a voltage-dependent gating mechanism in terms of an ‘electrical switch’ making this eukaryotic beta-barrel a promising target for nanopore based applications. In this work, new bioinformatics methods were developed and verified through practical approaches to shed light on the structural elements of Tom40 facilitating its particular function in mitochondria. Based on these results, Tom40 proteins were designed with modified and optimized structural properties. TmSIP, a physical interaction model developed for TM beta-barrel proteins, was used to identify weakly stable regions in the TM domain of Tom40 from mammals and fungi. Three unfavorable beta-strands were determined for human Tom40A. Via CD and Trp-fluorescence spectroscopy it was shown that substitution of key amino acid residues in theses strands resulted in an improved resistance of the protein to chemical and thermal perturbations. Further, the mutated form of hTom40A was strictly found in its monomeric state. Equal improvements were gained for the apparent stability of Tom40 from Aspergillus fumigatus. Tom40 was isolated and purified in its native state from Neurospora crassa mitochondria. Time-limited proteolysis of native NcTom40 coupled to mass spectrometry revealed comparable protease-accessibility to VDAC isoform 1 from mammals suggesting a similar fold. Thus, a homology model of NcTom40 was developed on the basis of the solved mouse VDAC-1 crystal structure. It was found that Tom40 forms a 19-stranded beta-barrel with an N-terminal alpha-helix inside the pore. Further, a conserved ‘polar slide’ in the pore interior is possibly involved in preprotein translocation and a second conserved domain, termed ‘helix anchor region’, in arresting the helix inside the Tom40 pore. Based on the homology model of NcTom40, the structure and function of the N-terminal domain of Tom40 was addressed. Examination of the model structure revealed two different domains for the N-terminus, the inner-barrel and outer-barrel N-terminus. In vivo investigations showed that both parts prevent a heat-induced dysfunction of Tom40 in N. crassa mitochondria independently. By applying CD spectroscopy the predicted N-terminal alpha-helix could be allocated to the inner-barrel N-terminus. Further, in combination with Trp-fluorescence spectroscopy it was found that the N-terminal alpha-helix unfolds independently from the Tom40 beta-barrel, but is not necessary for pore stability or integrity. However, a conserved amino acid residue, Ile47 of NcTom40, in the inner-barrel N-terminus is essential for the structural integrity of the N-terminal alpha-helix. In conclusion, these results may offer a basis for future works on TM beta-barrel proteins with the aim to alter the structural properties in the absence of a high atomic resolution structure or an established knowledge of the biochemical and biophysical properties.Item Open Access Biophysical investigations of the in vitro effects of shock waves and ultrasound(1993) Brümmer, Franz; Suhr, Dierk; Irmer, Ulrich; Bachleitner, Christoph; Hülser, Dieter F.To investigate the interactions of ultrasonic waves with biological tissues, we developed and standardized several in vitro models. Using these systems - artificial stones, human erythrocytes, L1210 mouse leukemia cells, multicellular spheroids, cavitation assay - we are able to elucidate the mechanisms of interaction as well as the cause of clinically observed side effects.Item Open Access Untersuchungen zur enzymatischen Enantiomerentrennung von Glykolethern und Etablierung neuer Methoden des synthetischen Shufflings(2004) Rusnak, Monika; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen geeigneten Biokatalysator für die Enantiomerentrennung des Modellsubstrats 1-Methoxy-2-Propanol (MP) bzw. seines Esters 1-Methoxy-2-Propanolacetat (MPA) bereitzustellen. In den letzten Jahren stieg das Interesse an den enantiomerenreinen Formen dieser Glykolether enorm. In dieser Arbeit richtete sich das Hauptaugenmerk auf die Evaluierung verschiedener Strategien zur Identifizierung bzw. Optimierung des Biokatalysators. Hierbei sollten sowohl Methoden der de novo Klonierung und der biochemischen Charakterisierung neuer Enzyme, wie auch der gerichteten Evolution und des rationalen Proteindesigns bereits bekannter Biokatalysatoren angewandt werden. Das so erhaltene Enzym sollte das Potenzial zum Einsatz in der chemischen Industrie haben, was hohe Anforderungen sowohl an Enantioselektivität wie auch an die Prozessstabilität eines Biokatalysators stellt. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die Lipase A aus Archaeoglobus fulgidus kloniert und charakterisiert werden. Dieses Enzym, welches sehr geringe Homologie zu anderen bekannten Hydrolasen aufwies, zeigte ein interessantes Profil, speziell in Bezug auf sein pH-Optimum, jedoch keine Hydrolyse von MPA. Es war bekannt, dass die Lipase B aus Candida antarctica (CalB) eine hohe Enantioselektivität vor allem bei der Hydrolyse von MPA zeigte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war daher die Abschätzung der Nutzbarkeit und Verfügbarkeit von CalB für die Enantiomerentrennung von MP / MPA. Die industrielle Anwendung von CalB ist durch die Patentierung dieses Enzyms durch Novozymes beschränkt. Die im zweiten Teil dieser Arbeit etablierte Expression von CalB in Pichia pastoris und die Übertragung des Expressionssystems auf den Fermentationsmaßstab schufen optimale Voraussetzungen für nachfolgende Experimente. Die bei dieser Expression erzielten Ausbeuten übertrafen die anderer Gruppen. Die erzeugten rationalen Mutanten zur Verbesserung der Selektivität in der Umesterung konnten keine Erhöhung der Enantioselektivität bewirken. Die hier erstmals gelungene funktionelle Expression von CalB in E.coli eröffnete jedoch die Möglichkeit zur gerichteten Evolution von CalB und dem Screening auch großer Mutantenbibliotheken, sowohl durch die Methode des Plattenscreenings wie auch durch FACS-Screening. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, günstige und schnelle Methode der Gensynthese entwickelt, die zur Darstellung der im vierten Teil der Arbeit verwirklichten Genbank verwendet wurde. Die so gewonnene Lipase 1 aus Moraxella sp. TA144 wurde funktionell in E.coli exprimiert und charakterisiert. Basierend auf der in dieser Arbeit etablierten Methode der Gensynthese konnte eine Genbank der CalB erstellt werden, die durch eine neue Methode des synthetisches Shuffling dargestellt wurde. Durch mehrere Evaluierungsansätze konnte die Sequenz der Genbank den Anforderungen gemäß optimiert werden, so dass das Auftreten ungewollter Mutationen minimiert werden konnte. In dem folgenden Hochdurchsatzscreening von 19000 Klonen der Genbank im vorher etablierten E.coli Expressionssystem konnte kein Klon mit Lipaseaktivität isoliert werden. Nichtsdestotrotz handelte es sich hierbei um einen interessanten neuen Ansatz der gerichteten Evolution, der nach Optimierung der Lipaseexpression bzw. des Screeningsystems und möglicherweise nach Herabsetzung des Degenerationsgrades zu neuen Biokatalysatoren mit interessanten Eigenschaften führen sollte. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass es zur enzymatischen Enantiomerentrennung von MPA im Moment keinen Ersatz zu CalB gibt. Durch die Etablierung der CalB-Expression in E.coli wurde die entscheidende Voraussetzung zur Optimierung der noch verbesserungswürdigen Enantioselektivität, vor allem in der Umesterungsreaktion, sowie der noch geringen Thermostabilität geschaffen. Der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz der gerichteten Evolution zeigte auf, dass bei evolutiven Mutagenesestrategien stets mehrere Variablen existieren, deren Auswirkungen auf das Ergebnis gegeneinander gewichtet werden müssen. So sollte die Variabilität der Mutantenbibliotheken hoch sein, um Klone mit möglichst neuen Kombinationen von gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Gleichzeitig sollte bedacht werden, dass die strukturelle Stabilität der Mutanten mit steigender Variabilität sinkt, so dass der verfügbare Sequenzraum stets begrenzt bleiben muss, um eine zufriedenstellende Ausbeute an funktionellen Klonen zu gewährleisten.Item Open Access Biological effects of shock waves(1990) Brümmer, Franz; Bräuner, Thomas; Hülser, Dieter F.Extracorporeal shock wave lithotripsy has become established worldwide as the method of choice for the treatment of nephrolithiasis and ureterolithiasis over the last 10 years. Although initial studies showed no damaging effects of the shock waves on organs and tissues, numerous recent reports have presented evidence for severe acute effects and chronic complications after shock wave treatment. The pathophysiological effects on kidneys and the histopathological effects on organs or tissues in man and animal, and also the effects on cells in culture and tumors are sumarized. Suspended and immobilized cell cultures were used to characterize and quantify the efficacy of shock wave. Extended applications of shock waves and possible modifications to shock wave generators are discussed.Item Open Access Construction of a super-competent Bacillus subtilis 168 using the PmtlA-comKS inducible cassette(2015) Rahmer, Regine; Morabbi Heravi, Kambiz; Altenbuchner, JosefCompetence is a physiological state that enables Bacillus subtilis 168 to take up and internalize extracellular DNA. In practice, only a small subpopulation of B. subtilis 168 cells becomes competent when they enter stationary phase. In this study, we developed a new transformation method to improve the transformation efficiency of B. subtilis 168, specially in rich media. At first, different competence genes, namely comK, comS, and dprA, were alone or together integrated into the chromosome of B. subtilis 168 under control of mannitol-inducible PmtlA promoter. Overexpression of both comK and comS increased the transformation efficiency of B. subtilis REG19 with plasmid DNA by 6.7-fold compared to the wild type strain 168. This transformation efficiency reached its maximal level after 1.5 h of induction by mannitol. Besides, transformability of the REG19 cells was saturated in the presence of 100 ng dimeric plasmid or 3000 ng chromosomal DNA. Studying the influence of global regulators on the development of competence pointed out that important competence development factors, such as Spo0A, ComQXPA, and DegU, could be removed in REG19. On the other hand, efficient REG19 transformation remained highly dependent on the original copies of comK and comS regardless of the presence of PmtlA-comKS. Finally, novel plasmid-free strategies were used for transformation of REG19 based on Gibson assembly.Item Open Access Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von RERE, einem Gen mit möglicher Relevanz bei der Tumorentstehung(2001) Wärner, Thomas Michael; Pfizenmaier, Klaus (Prof.)RERE (RE repeats encoded) ist ein kürzlich beschriebenes Gen welches in der distalen Region von Chromosom 1p lokalisiert ist. Für diese genomische Region wurde durch molekularbiologische und zytogenetische Studien eine konsistente strukturelle Veränderung in verschiedenen menschlichen Tumoren nachgewiesen. Die Neuroblastom Zelllinie NGP enthält eine reziproke chromosomale Translokation/Duplikation in dieser genomischen Region. Die genomische Sequenz von RERE wurde als die den Bruchpunkt überlagernde Sequenz in der Zelllinie NGP nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die genomische Struktur von RERE beschrieben und die cDNA einer neuen RERE Splicevariante isoliert. In allen untersuchten humanen Geweben wurden mittels Northern blotting zwei dominante RERE-Transkripte nachgewiesen und diese als mögliche Splice Varianten identifiziert. Darüber hinaus wurde in allen untersuchten Tumorzelllinien mittels Western blotting zwei dominante Proteinbanden mit einem RERE Immunserum nachgewiesen. In 2 von 18 untersuchten Tumorzelllinien wurde zusätzlich jeweils eine kleinere dominante Proteinbande detektiert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß überexprimiertes RERE in PML Oncogenic Domains (PODs) lokalisiert ist und mit den pro-apoptotischen Proteinen PML, BAX und mit Mitochondrien kolokalisiert. Bei RERE transfizierten Zellen wurde durch unterschiedliche Methoden Apoptose nachgewiesen. Durch die Untersuchung verschiedener RERE Proteinfragmente (gesamtes RERE und N- oder C-terminale Deletionsmutanten von RERE) konnte die Region beschrieben werden, die eine Kolokalisierung von RERE und PODs unterstützt und nachdem sie in verschiedene Zelllinien transfiziert wurde, mit dem Nachweis von Apoptose korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen ersten Hinweis auf die Funktion von RERE. RERE könnte eine Verbindung zwischen PODs und der Kontrolle von Apoptose darstellen und somit eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen.Item Open Access Transformation von B. subtilis 168 : Optimierung und Regulation des Transkriptionsfaktors ComK(2017) Franzen, Regine; Mattes, Ralf (Prof. Dr. rer. nat.)Item Open Access Physical interactions strengthen chemical gelatin methacryloyl gels(2019) Rebers, Lisa; Granse, Tobias; Tovar, Günter E. M.; Southan, Alexander; Borchers, KirstenChemically cross-linkable gelatin methacryloyl (GM) derivatives are getting increasing attention regarding biomedical applications. Thus, thorough investigations are needed to achieve full understanding and control of the physico-chemical behavior of these promising biomaterials. We previously introduced gelatin methacryloyl acetyl (GMA) derivatives, which can be used to control physical network formation (solution viscosity, sol-gel transition) independently from chemical cross-linking by variation of the methacryloyl-to-acetyl ratio. It is known that temperature dependent physical network formation significantly influences the mechanical properties of chemically cross-linked GM hydrogels. We investigated the temperature sensitivity of GM derivatives with different degrees of modification (GM2, GM10), or similar degrees of modification but different methacryloyl contents (GM10, GM2A8). Rheological analysis showed that the low modified GM2 forms strong physical gels upon cooling while GM10 and GM2A8 form soft or no gels. Yet, compression testing revealed that all photo cross-linked GM(A) hydrogels were stronger if cooling was applied during hydrogel preparation. We suggest that the hydrophobic methacryloyl and acetyl residues disturb triple helix formation with increasing degree of modification, but additionally form hydrophobic structures, which facilitate chemical cross-linking.