Biosynthese von N-Heterocyclen mittels Putrescinoxidase und Iminreduktase

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer neuen Enzymkaskade zur Synthese von N-Heterocyclen. Vor allem chirale N-Heterocyclen bilden wichtige Vorstufen für die Synthese von Pharmazeutika oder Agrochemikalien und sind daher von besonderem industriellem Interesse. Über 90% der potenziellen pharmazeutischen Wirkstoffe beinhalten Stickstoff und viele davon in Form von substituierten Piperidinderivaten, weswegen stetig nach neuen Synthesewegen gesucht wird. Für die Entwicklung einer neuen alternativen Enzymkaskade wurden die Putrescinoxidase von Rhodococcus erythropolis (PuO-Re) und die (R)-selektive Iminreduktase von Streptosporangium roseum (IRED-Sr) oder die (S)-selektive Iminreduktase von Paenibacillus elgii (IRED-Pe) gewählt um chirale N-Heterocyclen ausgehend von Diaminderivaten, die z.B. über die Decarboxylierung von Aminosäuren zugänglich sind, herzustellen. In dieser Kaskade oxidiert die PuO-Re eine Aminogruppe der Diamine, wodurch ein Aminoketon entsteht. Dieses Aminoketon cyclisiert spontan unter Bildung einer Schiff-Base, dieses Imin kann dann von der Iminreduktase mit dem Kofaktor NADPH zum gesättigten N-Heterocyclus reduziert werden. Da die Aktivität der PuO-Re für längerkettige oder verzweigte Diamine im Vergleich zum natürlichen Substrat 1,4-Diaminobutan drastisch abnimmt, wurde ein semi-rationales Design durchgeführt um die Aktivität gegenüber Diaminopentanderivaten zu steigern und das Substratspektrum zu erweitern. Dabei konnten zwei Varianten identifiziert werden, die eine gesteigerte Umsatzzahl für ebendiese Substrate aufweisen. Um eine weitere Steigerung der Aktivität zu erreichen wurde ein rationales Design für die aktive Tasche angewendet, dabei konnte eine Variante erstellt werden, die aliphatische Monoamine als Substrat akzeptiert und weitere zwei Varianten mit gesteigerter Aktivität gegenüber 1,5-Diaminohexan. Mit der Variante, die aliphatische Monoamine als Substrate akzeptiert, konnte gezeigt werden, dass die PuO-Re bei verzweigten Aminen, die weniger gehinderte Aminogruppe oxidiert. Alle positiven PuO-Re Varianten wurden erfolgreich mit den beiden IREDs kombiniert und die beste Umsetzung eines substituierten Diamins resultierte in vitro in 90% Produktbildung. Erstaunlicherweise konnte bei der Umsetzung von 1,5-Diaminohexan zu 2-Methylpiperidin in der Kaskade ein Switch im Enantiomerenüberschuss, zwischen den PuO-Re Varianten aus dem semi-rationalen Design und dem rationalen Design der aktiven Tasche, beobachtet werden. Somit konnte in der aktiven Tasche die Position 206 identifiziert werden, die verantwortlich ist für die Unterscheidung der Enantiomere von 1,5-Diaminohexan. Des Weiteren wurde die Kaskade mit einer der PuO-Re Variante in Kombination mit der IRED-Sr in ein in vivo System übertragen. Dabei konnte durch Variation des E. coli Stammes und durch Reaktionsoptimierung die Produktbildung von 3-Methylpiperidine aus 1,5-Diamino-2-methylpentan von 10% auf 83% gesteigert werden. Eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen in Kooperation mit Sanofi führte zu einer Umsetzung von fast 30 mM 1,5-Diamino-2-methylpentan zu 3-Methylpiperidin in einem 20 L Reaktor.