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Authors: Trauzettel, Philipp Otto
Title: O-Methyltransferasen für die chemo- und regioselektive Alkylierung phenolischer Synthesebausteine
Other Titles: O-methyltransferases for the chemo- and regioselective alkylation of phenolic building blocks
Issue Date: 2019
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
metadata.ubs.publikation.seiten: XVIII, 183
URI: http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/10350
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-103502
http://dx.doi.org/10.18419/opus-10333
Abstract: Die Alkylierung kleiner Synthesebausteine mit unterschiedlich funktionalisierten Resten gehört zu den wichtigsten Reaktionen der organischen Synthese industriell wichtiger Substanzen wie zum Beispiel Pharmazeutika oder Aromastoffe. Die größte Herausforderung ist dabei die chemo , enantio- und regioselektive Modifikation von multifunktionalisierten Strukturen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Katalysepotential der O Methyltransferasen PFOMT aus Mesembryanthemum crystallinum, BcOMT2 aus Bacillus cereus und IEMT aus Clarkia breweri untersucht. Mit diesen sollten synthetisch wichtige Kernstrukturen regioselektiv an einzelnen Hydroxygruppen methyliert bzw. durch den Einsatz von Kofaktor-Analoga mit längeren Alkylresten für eine Folgechemie funktionalisiert werden. Aktivitätsmessungen mittels eines substratunabhängigen HPLC-Screeningassays mit Benzyl-, Catechol-, Pyridin-, Naphthol-, Chinolin-, Coumarin-, Flavonoid- und Benzo-phenon-Derivaten zeigten, dass alle drei Enzyme Substrate methylieren, die ein vicinales, dihydroxyliertes Motiv an einem aromatischen Ringsystem besitzen. PFOMT konnte die Substrate dabei am effektivsten umsetzen und toleriert auch zusätzliche Funktionalisierungen am Ringsystem wie z.B. Halogenierungen, Hetero-zyklen oder Nitro- bzw. Aminogruppen. IEMT war zudem in der Lage auch Substrate zu methylieren, bei denen die Hydroxygruppen nicht unmittelbar nebeneinander positioniert sind, wenn auch mit stark verringerter Aktivität. Die anschließende Untersuchung der Regioselektivität der drei Methyltransferasen mit ausgesuchten Substraten zeigte, dass PFOMT eine strikte meta-Regioselektivität aufweist, während BcOMT2 auch zu geringen Anteilen die para-Position methyliert. IEMT hingegen methyliert bevorzugt die para-Hydroxygruppe der getesteten Substrate. Mittels einer fokussierten Mutantenbibliothek von PFOMT konnten Aminosäuren auf beweglichen Loopregionen (Y51 und M199) identifiziert werden, die ausschlaggebend für dessen strikte meta-Selektivität sind. Der Vergleich zu Literaturbekannten O-Methyltransferasen ähnlicher Struktur, jedoch mit einer para-Selektivität, zeigt, dass sich die flexiblen Loops in dieser Enzymklasse stark unterscheiden und damit die Regioselektivität beeinflussen. Zusätzlich hat jedoch auch die Struktur des Substrates einen starken Einfluss auf dessen Positionierung im aktiven Zentrum und folglich auf die Regioselektivität. Durch den Einsatz von Methionin-Analoga und literaturbekannten Varianten der humanen Methionin Adenosyltransferase hMAT2A war es möglich mit denselben Methyltransferasen Ethyl-, Allyl-, Propargyl-, Cyanomethyl-, Ethylazid-, Fluoro-methyl- und Fluoroethyl-Reste auf das Substrat 3,4 Dihydroxyacetophenon zu übertragen. Die Aktivität ist, mit Ausnahme des Allyl- und Ethyl-Analoga, jedoch deutlich geringer als mit dem natürlichen Kofaktor SAM. Durch eine Vergrößerung der aktiven Tasche von PFOMT im Bereich des zu übertragenden Alkylrestes durch rationales Enzymdesign (bump-hole Strategie) konnte für einzelne Analoga die Aktivität um das bis zu Dreifache erhöht werden.
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