Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-10486
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dc.contributor.advisorKontermann, Roland (Prof. Dr.)-
dc.contributor.authorLindner, Robert-
dc.date.accessioned2019-08-02T08:51:42Z-
dc.date.available2019-08-02T08:51:42Z-
dc.date.issued2019de
dc.identifier.other1670502805-
dc.identifier.urihttp://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/10503-
dc.identifier.urihttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-ds-105033de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.18419/opus-10486-
dc.description.abstractDie vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines präparativen Herstellungsprozesses für ein PEGyliertes, humanisiertes Antikörperfragment (scFv) welches gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor gerichtet ist. Dies beinhaltet die Optimierung der prokaryotischen Expression in Escherichia coli BL21 DE3 rha- mittels Hochzelldichtekultivierung. Durch Zugabe von Rhamnose erfolgt die Transkription des Zielproteingenes durch Aktivierung des rhaBAD Promotors. Um eine korrekte Faltung und Ausbildung der Disulfidbrücken im Zielprotein zu gewährleisten wird direkt nach der Translation mit Hilfe des pelB-Signalpeptides der Proteintransfer in den periplasmatischen Raum veranlasst. Durch Identifikation der optimalen Bedingungen war es möglich die spezifische Produktbildungsrate signifikant zu erhöhen und somit die volumetrische Ausbeute bis auf 0,73 g/L zu steigern. Das scFv, welches zum Zeitpunkt der Ernte in gelöster Form im Periplasma vorlag, konnte durch einen optimierten Extraktionsschritt vom Großteil der Wirtzellkomponenten getrennt werden. Hierfür wurde ein kombiniertes Verfahren entwickelt, welches einen Einfrier- und Auftauschritt mit einem osmotischen Schock und anschließender saurer Fällung von Wirtzellproteinen kombiniert. Dadurch konnten zwei Drittel des produzierten scFv-hu225 mit einer Reinheit von etwa 20 % für den nachfolgenden Reinigungsprozess bereitgestellt werden. Die weitere Reinigung des scFv bis hin zur pharmakologischen Qualität erfolgte, ohne Inkludierung von Diafiltrationsschritten, durch eine Kaskade von drei bis vier aufeinanderfolgenden Chromatographieschritten. Als innovativ gilt hierbei die Verwendung einer Mixed-Mode-Chromatographie als gleichzeitige Capturing- und Entsalzungsmethode. Dadurch konnte direkt im Anschluss eine Anionenaustauscher-Chromatographie zur Bindung von Endotoxinen und Nukleinsäuren zur Anwendung gebracht werden. Zur Verringerung des Wirtzellproteinanteiles wurde im Anschluss in orthogonaler Funktionsweise ein Kationenaustauscher verwendet. Als optionalen Schritt wurde eine Hydroxylapatit-Chromatographie in negativer Funktionsweise entwickelt. Da der gesamte Reinigungsprozess auch im scale-up möglichst ökonomisch und unter GMP umsetzbar sein sollte, wurde er so entwickelt, dass dieser innerhalb eines Tages durchgeführt werden konnte. Es wurde dabei eine Reinheit von über 99 % erreicht. Die volumetrische Ausbeute an scFv-hu225 lag mit einer Wiederfindung von über 50 % bei 0,38 g pro Liter Fermentation. Um die pharmazeutische Halbwertszeit des gereinigten Wirkstoffes zu verlängern wurde das Molekulargewicht, mittels der Kopplung von Polyethylenglycol (PEGylierung), erhöht. Die Reaktion erfolgte in diesem Fall ungerichtet durch Aldehyd-Chemie an primäre Amine. Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine 5 kDa mit einer 30 kDa PEGylierung bezüglich der Prozessführung und dem in vivo Verhalten miteinander verglichen, wobei der Fokus auf einem mono-PEGylierten Produkt lag. Es stellte sich heraus, dass mit zunehmendem PEGylierungsgrad eine Trennung von mono-PEGylierten Zielprotein schwieriger und unwirtschaftlicher wird. Die Pharmakokinetik konnte nachweislich nur mit der 30 kDa PEGylierung signifikant erhöht werden.de
dc.language.isodede
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessde
dc.subject.ddc570de
dc.titleProzessentwicklung zur Produktion und Reinigung eines PEGylierten Antikörperfragmentesde
dc.typedoctoralThesisde
ubs.dateAccepted2019-04-25-
ubs.fakultaetEnergie-, Verfahrens- und Biotechnikde
ubs.institutInstitut für Zellbiologie und Immunologiede
ubs.publikation.seitenXVI, 161de
ubs.publikation.typDissertationde
ubs.thesis.grantorEnergie-, Verfahrens- und Biotechnikde
Appears in Collections:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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