Regulation der Gene für die Verwertung von Rhamnose und Heteromannan in Bacillus subtilis

Abstract

In dieser Arbeit wurde die Regulation der Gene für die Verwertung von L-Rhamnose (rhaEWRBMA) und der Hemicellulose Heteromannan (gmuBACDREFG) in Bacillus subtilis untersucht. Die Abbaugene sind jeweils in einem Operon mit einem internen Regulatorgen (rhaR bzw. gmuR) zusammengefasst. Die Regulation des Rhamnose-Promotors (PrhaEW) wurde mittels lacZ-Reporteranalysen untersucht. PrhaEW wird durch den DeoR-ähnlichen Regulator RhaR negativ reguliert und durch Rhamnose induziert. Außerdem unterliegt die Expression des Rhamnose-Operons der Kohlenstoff-Katabolitrepression und wird bei gleichzeitiger Anwesenheit einer bevorzugten Kohlenstoffquelle wie Glucose über eine funktionelle cre-Sequenz (für catabolite responsive element) innerhalb von PrhaEW unterdrückt. L-Rhamnose wird in B. subtilis durch 5 enzymatisch katalysierte Schritte zu L-Lactat und Dihydroxyacetonphosphat umgesetzt. Durch Deletion der einzelnen Strukturgene wurde in vivo gezeigt, dass das phosphorylierte Intermediat Rhamnulose-1-Phosphat (R1P) der eigentliche Induktor ist. Mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde die spezifische Interaktion des Repressors RhaR mit seinem Operator stromaufwärts des ersten Gens nachgewiesen. In Abhängigkeit von der RhaR-Konzentration konnte die Bildung von zwei unterschiedlich großen PrhaEW-RhaR-Komplexen beobachtet werden, die in Gegenwart des Effektormoleküls R1P wieder dissoziierten. In DNase I-Footprinting-Experimenten wurden zwei durch RhaR geschützte Bereiche identifiziert. Der erste, größere Sequenzabschnitt (38-45 nt) enthält eine direkte Sequenzwiederholung aus zwei 17 bp langen Sequenzen CAAAAA(T/C)AAACA(A/G)AAA(C/T), die unerlässlich für die RhaR-Bindung ist. Diese RhaR-Bindestelle konnte auch durch eine Deletionsanalyse von PrhaEW sowie durch komplementäre Basensubstitutionen, die blockweise eingeführt wurden, bestätigt werden. In der kürzeren zusätzlich durch RhaR geschützten Region (22 nt) tritt das von der ersten Bindestelle abgeleitete 17 bp lange Sequenzmotiv CAAAAACAAACANAAAT mit wenigen Abweichungen erneut auf. Eine Gel-Permeations-Chromatographie ergab, dass RhaR in Lösung als Monomer vorliegt. Daher binden in Abwesenheit von Rhamnose vermutlich drei RhaR-Monomere an diese drei direkt wiederholten Sequenzen im Bereich der -35 und der -10 Region und verhindern die Bindung der RNA-Polymerase. Die Tatsache, dass B. subtilis mit Rhamnose als einziger Kohlenstoffquelle kaum wächst, könnte an dem Fehlen eines Transporters liegen. Durch die heterologe Expression eines Gens für eine mutmaßliche Rhamnose-Permease (rhaY) aus Oceanobacillus iheyensis konnte das Wachstum auf Rhamnose deutlich verbessert werden. Warum aber dafür eine extrem lange Adaptationszeit nötig war, konnte nicht geklärt werden. Das Glucomannan-Operon (gmu-Operon) von B. subtilis kodiert für Gene, die mutmaßlich für die Regulation, die extrazelluläre Hydrolyse von β-1,4-Heteromannan-Polysacchariden sowie die Aufnahme und den Abbau der dabei entstehenden oligomeren β-Mannoside verantwortlich sind. Hier durchgeführte genetische Analysen deuten darauf hin, dass die Oligosaccharide intrazellulär bis zum Monomer D-Mannose hydrolysiert werden. Durch Promotorstudien mit lacZ als Reporter und dem einzigen, vor dem ersten Gen gmuB liegenden Promotor (PgmuB) wurde gezeigt, dass das gmu-Operon neben Glucomannan auch durch Galactomannan induziert werden kann. Die Messungen der Promotoraktivität in Stoffwechselmutanten der Heteromannan-Verwertung lassen darauf schließen, dass es sich bei dem Effektormolekül des Repressors GmuR um ein phosphoryliertes Abbauprodukt der extrazellulären Mannanase GmuG (vermutlich β-1,4-Mannobiose) handelt, welches durch Aufnahme über ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Transportsystem entsteht. Durch EMSA wurde gezeigt, dass der GntR/HutC-ähnliche Repressor GmuR an seinen Operator stromaufwärts des gmu-Operons bindet und dabei, abhängig von der Proteinkonzentration, nacheinander zwei PgmuB-GmuR-Komplexe mit unterschiedlicher Mobilität ausbildet. Dieser Arbeit vorausgegangene bioinformatische Studien sagten eine 18 bp lange Bindestelle für GmuR vorher (IR1), die mittig das konservierte DNA-Motiv der HutC-Familie (GTNTANAC) enthält. Diese zentrale Sequenz, welche mit der -35 Region überlappt, wird von zwei inversen 7 bp langen Wiederholungen umgeben. Der entsprechende Bereich wurde im DNase I-Footprinting-Experiment durch GmuR geschützt. Allerdings folgte auf den 37 nt großen Abschnitt ein zusätzlicher kleinerer geschützter Abschnitt (10 nt) der die -10 Region bedeckt. Dieser Bereich enthält eine weitere invertierte Wiederholung des 7 bp langen DNA-Motivs TAAWWGT mit geringen Nukleotidabweichungen (‘IR2). Durch komplementäre Basensubstitutionen wurde bestätigt, dass diese Sequenz Einfluss auf die Affinität von GmuR hat. Ein Modell wurde vorgeschlagen, bei dem ein GmuR-Dimer an IR1 und ein weiteres an ‘IR2 bindet, wodurch die Bindung der RNA-Polymerase an den gmuB-Promotor blockiert wird.

In this study the regulation of the L-rhamnose and the hemicellulose heteromannan utilization genes of Bacillus subtilis (rhaEWRBMA and gmuBACDREFG, respectively) was investigated. The degradation genes each constitute an operon with an internal regulator gene (rhaR and gmuR, respectively). The regulation of the rhamnose promoter (PrhaEW) was studied by assaying the reporter gene (lacZ) expression. PrhaEW is negatively regulated by the DeoR-type transcriptional regulator RhaR and is induced by rhamnose. Furthermore, the expression of the L rhamnose operon is subjected to carbon catabolite control (CCR) and is repressed in the presence of a preferred carbon source such as glucose. A functional catabolite-responsive element (cre) is located within PrhaEW and mediates CCR. In B. subtilis the conversion of L-rhamnose to L-lactate and dihydroxyacetone phosphate is catalyzed by the sequential action of four enzymes. As has been shown in vivo by single deletion of the structural genes, the phosphorylated intermediate, rhamnulose 1-phosphate (R1P), is the actual inducer of PrhaEW. The specific interaction between the repressor RhaR and its DNA operator region upstream of the first gene was confirmed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The formation of two PrhaEW-RhaR complexes with different mobility was observed, depending on the RhaR concentration, and they dissociated in the presence of the effector R1P. Two regions that were protected by RhaR were identified by DNase I footprinting experiments. The larger first region (38-45 nt) contains a direct repeat that is composed of two 17-bp sequences CAAAAA(T/C)AAACA(A/G)AAA(C/T), which are indispensable for the binding of RhaR. In addition, this RhaR binding site was confirmed by deletion analysis and block scanning mutagenesis of PrhaEW. The smaller second region, also protected by RhaR (22 nt), includes a third direct repetition of the proposed 17-bp sequence motif CAAAAACAAACANAAAT with little divergence. In solution, RhaR is a monomer as concluded from gel permeation chromatography. Therefore, in the absence of rhamnose, presumably three RhaR monomers bind to these three directly repeated sequences located around the -35 and the -10 region, thereby blocking the binding of the RNA polymerase. The fact that B. subtilis only grows poorly with rhamnose as the sole carbon source might be explained by the missing of a transporter. Growth with rhamnose was clearly improved by heterologous expression of a gene for a putative rhamnose permease (rhaY) from Oceanobacillus iheyensis. It could not be clarified why an extremely long adaption time was necessary. The glucomannan utilization (gmu) operon of B. subtilis encodes gene products putatively responsible for regulation, extracellular hydrolysis of β-1,4-linked heteromannan polysaccharides as well as uptake and degradation of the resulting oligomeric β-mannosides. Genetic analysis carried out in this study indicate that the oligosaccharides are hydrolyzed intracellular to the monomer D-mannose. Analysis of the single promoter upstream of the first gene gmuB (PgmuB) fused to the lacZ gene reporter revealed that besides glucomannan the gmu operon can also be induced by galactomannan. Measurements of promoter activity in different mutants deficient in glucomannan metabolism suggest that the effector molecule of the GmuR repressor is a phosphorylated degradation product of the extracellular mannanase GmuG (presumably β-1,4-mannobiose), which arises from the uptake by a phosphoenolpyruvate-dependent transport system. Using EMSA, it has been shown that the GntR/HutC family repressor GmuR binds to its operator upstream of the gmu operon. When the protein concentration was increased, GmuR sequentially forms two PgmuB-regulator complexes that migrate with different electrophoretic mobilities. In previous bioinformatic studies, a 18-bp binding site for GmuR was proposed (IR1), that comprises the conserved DNA motif in the HutC family (GTNTANAC). This central sequence that overlaps the -35 region is flanked by a 7-bp inverted repeat (TAAWWGT). The corresponding region was protected by GmuR against DNase I attack. However, the protected area (extending over 37 nt) was followed by a smaller second one (10 nt) covering the -10 region. This sequence includes an additional repetition of the right half of the inverted repeat with low discrepancy (‘IR2). Block scanning mutagenesis was used to confirm that this sequence is also required for high affinity binding of GmuR. A model was proposed in which one GmuR dimer binds to IR1 and a second GmuR dimer binds to ‘IR2, whereby the binding of RNA polymerase to the gmuB promoter is blocked.